خاموشی ژن bZIP14 با استفاده از CRISPR/Cas9 و بررسی موتانت ها در پاسخ به تنش شبکه آندوپلاسمی در گیاه Marchantia polymorpha

انباشته شدن پروتئین های تانخورده و بد-تاخورده سبب تنش شبکه آندوپلاسمی می شود. در پاسخ به تنش شبکه آندوپلاسمی، پاسخ به پروتئین تانخورده (UPR) توسط حس گرهای تراغشایی شبکه آندوپلاسمی راه اندازی می شود. این مسیر مجموعه ای از سیگنال های پیام رسان یکپارچه است که برای بازگرداندن پایداری شبکه آندوپلاسمی طراحی شده است. دو فاکتور رونویسی bZIP به نام های bZIP14 و bZIP7 مسیر UPR را در گیاه Marchantia polymorpha تنظیم می کنند. در این مطالعه لاین های موتانت bzip14 با استفاده از فناوری CRISPR/Cas9 در گیاه مارکانتیا جمع آوری شده است. بدین منظور توالی DNA ژن bZIP14 در پایگاه اطلاعاتی Marchantia.info به کمک Blastp برای گیاه مارکانتیا شناسایی شد. بدین منظور، توالی DNAی ژن  bZIP14 با انجام بلاست پروتئینی در وبگاه Marchantia.info شناسایی شد. توالی اگزون به منظور شناسایی sgRNAها در پایگاهhttp://crispor.tefor.net/  وارد و از میان sgRNAهای پیشنهادی، سه کاندید انتخاب شدند. sgRNAها درون سازه اختصاصی CRISPR/Cas9 برای گیاه مارکانتیا به نام pMpGE013 وارد و پس از انتقال به اگروباکتری سویه GWB303+pSOUP به گیاه انتقال داده شد. از گیاهان باززا شده در محیط انتخابی دارای هایگرومایسین، استخراج DNA انجام و پس از تکثیر با پرایمرهای اختصاصی، برای توالی یابی ارسال شد. هشت لاین از 11 لاین با توالی صحیح، تغییرات نوکلیوتیدی حذف و اضافه در توالی DNA نشان دادند. یک لاین موتانت انتخاب و برای ارزیابی فنوتیپی و آزمون زنده مانی به محیط حاوی ترکیب تونیکامایسین، ماده شیمیایی القا کننده تنش شبکه آندوپلاسمی انتقال یافت. بررسی ها نشان داد که bZIP14 تنها هومولوگ ژن های bZIP17 و bZIP28 در گیاه آرابیدوپسیس است. همچنین تحت تنش شبکه آندوپلاسمی، گیاهان موتانت در مقایسه با گیاهان وحشی تفاوت معناداری در سطح 5 درصد نشان داده اند.