راه اندازی و ارزیابی الایزای غیرمستقیم ویروس های کاپری پاکس با استفاده از بیان پروتئین P32 کوتاه شده در Ecoli

بیماری لامپی اسکین (LSD)، آبله ی گوسفندی (SPP) و آبله بزی (GTP)، به عنوان بیماری های اخطارکردنی، آثار شگرفی بر صنعت پرورش گاو، گوسفند و بز دارد. ایجاد و راه اندازی روش الایزا می تواند به طور موثری به تشخیص سرمی حیوانات آلوده کمک نماید. این پژوهش با هدف راه اندازی یک سیستم الایزا بر اساس پروتئین های نوترکیب P32 کامل و کوتاه شده (Tr.P32) ویروس آبله ی بزی انجام شد. پروتئین P32 با استفاده از وکتور pET24a+ در سویه Rostta باکتری Ecoli بیان شد و با استفاده از روش های SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ ارزیابی شد. سپس Tr.P32 در شرایط واسرشته سازی با استفاده از روش Ni-NTA کروماتوگرافی افینیتی خالص سازی، و برای راه اندازی الایزای اختصاصی ویروس های کاپری پاکس استفاده شد. سپس با روش تیتراسیون چکربورد و آنالیز ROC به ترتیب برای بهینه سازی سیستم الایزا و تعیین اختصاصیت و حساسیت آن استفاده شد. پتانسیل تشخیصی سیستم الایزای طراحی شده با استفاده از سرم های کنترل مثبت و منفی جمع آوری شده از بز، گوسفند و گاو ارزیابی شد. نتایج نشان داد که بیان پروتئین کامل P32 ناچیز بود در حالی که Tr.P32، به عنوان یک پروتئین نوترکیب 31 کیلو دالتونی، تا سطح 300/0-270/0 میلی گرم به ازای هر 200 میلی لیتر محیط کشت بیان شد. نتایج بهینه سازی با روش چکربورد نشان داد که 675 نانوگرم Tr.P32 به ازای هر چاهک و رقت 1:10 از سرم های کنترلی (سرم های هایپرایمیون ضد ویروس آبله ی بزی و سرم های غیر ایمن) بیشترین اختلاف در جذب نوری بین نمونه های سرمی مثبت و منفی بزی را در پی داشت. پروتئین نوترکیب Tr.P32 واکنش خوبی با آنتی بادی علیه ویروس های آبله ی بزی (GTPV)، آبله ی گوسفندی (SPPV) و ویروس عامل LSD (LSDV) داشت، در حالی که هیچ گونه واکنش متقاطعی با ویروس Orf نشان نداد. با مقایسه نتایج شاخص خنثی سازی (NI)، cut off، و حساسیت و اختصاصیت تشخیصی سیستم الایزای غیرمستقیم طراحی شده به ترتییب 397/0، 94% و 6/96 درصد اندازه گیری شد. این یافته ها نشان داد که سیستم الایزای طراحی شده بر اساس پروتئین Tr.P32 می تواند برای استفاده در تشخیص سرمی همه ی ویروس های کاپری-پاکس استفاده شود؛ با این حال، لازم است مطالعات بیشتری در این زمینه انجام شود.