شناسایی یکی از موتیف های موثر در پایداری پروتئین ATG8B در جایگاه LDS در گیاه Marchantia polymorpha

اتوفاژی یکی از پاسخ های دفاعی در موجودات مختلف در شرایط تنش و غیرتنش است. در اتوفاژی، ترکیبات و اندامک های آسیب دیده درون وزیکول دو غشایی به نام اتوفاگوزوم قرار می گیرند و به سمت واکویل هدایت می شوند تا توسط آنزیم های هیدرولیتیکی واکویل تخریب و به مواد اولیه تجزیه شوند. پروتیین ATG8 مشخصه مسیر اتوفاژی است که در شکل گیری اتوفاگوزوم و قرارگیری محموله های هدف برای تخریب شدن درون اتوفاگوزوم نقش دارد. در مسیر اتوفاژی انتخابی، حضور پذیرنده محموله برای قرارگیری محموله درون اتوفاگوزوم نقش مهمی ایفا می کند. پذیرنده ها دارای موتیف اتصال به ATG8 به نام AIM یا LIR هستند که می توانند با دمین LDS که جایگاه اتصال AIM/LIR درATG8 است، میانکنش دهند. هرگونه تغییر در جایگاه LDS و یا موتیف AIM، سبب برهم خوردن میانکنش ATG8 و پذیرنده می شود. در تحقیق حاضر، گیاه Marchantia polymorpha با ATG8B جهش یافته در جایگاه LDS از طریق جهش هدفمند در محل، ایجاد شدند تا برای مطالعات آتی برای شناسایی پذیرنده های احتمالی مورد استفاده قرار گیرند. بدین منظور از طریق بلاست پروتیینی، توالی پروتیین ATG8B در گیاه مارکانتیا در پایگاه اطلاعاتی Marchantia.info شناسایی شد. از طریق هم ردیفی پروتیین های ATG8A از گیاه آرابیدوپسیس با ATG8B گیاه مارکانتیا، اسیدآمینه هایی که در تاخوردگی ATG8 و شکل گیری جایگاه LDS نقش دارند، شناسایی شدند. دو آمینواسید لیزین 51 و آرژنین 70، جداگانه با روش جهش هدفمند در محل با آمینواسید آلانین جایگزین شدند. سپس پروتیین فلورسنت GFP با کمک فناوری گرین گیت به پروتیین جهش یافته ATG8B اتصال یافت. به منظور حفظ شرایط یکسان با گیاهان حاوی ژن ATG8B وحشی موجود در آزمایشگاه، با طراحی آغازگرهای سازگار با گیت وی، پروتیین های جهش یافته درون سازه بیانی pMpGWB303 وارد و پس از انتقال به اگروباکتری سویه GWB303+pSOUP به گیاه انتقال داده شد. بررسی گیاهان تراریخته در آزمایشات وسترن بلات نشان داد که تنها فرم تغییر یافته لیزین به آدنین قابلیت بیان شدن و تشکیل پروتیین پایدار را دارد، در حالیکه با تغییر آرژنین به آلانین، پروتیین پایداری خود را از دست داده و قابلیت بیان ندارد.