بیان نوترکیب بخش C-ترمینال پروتئین Rif1 و محلول سازی آن با سارکوزیل

ژنوم یوکاریوتی حاوی چندین محل شروع همانندسازی می باشد. بررسی ها نشان می دهد که روند و ترتیب فعال شدن این منشاها با نظم خاصی صورت می گیرد که این فرآیند منظم را اصطلاحا زمانبندی همانندسازی (Replication timing) می-گویند. مطالعات اخیر نشان می دهد که فاکتورهای زیادی در تنظیم زمانبندی فرآیند همانندسازی نقش دارند. یکی از مهمترین این فاکتورها پروتیین متصل شونده به Rap1 (Rif1)، می باشد که نقش اساسی را در تنظیم برنامه زمانبندی همانندسازی در مخمر و یوکاریوت های پیشرفته تر ایفا می کند. قسمت عمده ساختار این پروتیین به صورت نامنظم بوده و این ویژگی ها مانع از بیان Rif1 به صورت پایدار شده و مطالعه بر روی آن را دشوار می کند. هدف از مطالعه کنونی بیان نوترکیب دمین C-ترمینال پروتیین Rif1 موشی (muRif1-CTD) به صورت محلول می باشد. بدین منظور ژن muRif1-CTD از سازه یوکاریوتی حاوی ژن کامل Rif1 به کمک PCR استخراج و در وکتور بیانی pPAL7 که حاوی برچسب Profinity eXact بود، قرار گرفت. محلول سازی پروتیین با استفاده از دترجنت های مختلف و در مرحله بعد حذف دترجنت با استفاده از دیالیز صورت پذیرفت. به منظور اطمینان از اینکه پروتیین محلول شده دارای فعالیت است آنالیز برهمکنش پروتیین Rif1 با ساختار G4 (که قبلا در رابطه با اتصال به Rif1 معرفی شده بود) با روش ژل شیفت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی نشان داد که استفاده از دترجنت می تواند برای محلول سازی پروتیین Rif1 بدون اثرگذاری بر مراحل خالص سازی آن مورد استفاده قرار گیرد. لیکن در مورد این پروتیین در صورت فقدان کامل دترجنت، این پروتیین به صورت محلول نخواهد بود.