طراحی و ساخت کاست رمزکننده عامل رشد اپیدرمی انسانی برای بیان در بذر گیاه جو

گیاهان کارآیی بسیاری در تولید پروتیین های ارزشمند دارویی دارند. عامل رشد اپیدرمی انسانی، اثرات بی شماری بر روی سیستم های مختلف سلولی داشته و نقش مهمی در بهبودی زخم ها و اندام زایی دارد. هدف از پژوهش اخیر ساخت سازه های ویژه تک لپه ای ها برای انتقال بعدی ژن عامل رشد اپیدرمی و تولید انبوه آن در یک گیاه تک لپه ای خودگشن یعنی جو بود. گیاه جو با داشتن عملکرد پروتیینی بالا و دگرگشنی بسیار پایین، میزبان ایده الی برای تولید عامل رشد اپیدرمی است.

 به منظور دسترسی به بالاترین میزان بیان عامل رشد اپیدرمی در بذر جو، توالی ژن موردنظر بر اساس ترجیح کدونی گیاه جو با نرم افزار COOL بهینه و همراه با پیش بر اختصاصی دی هوردیین سنتز شد. همچنین توالی راهنمای پپتیدی اندامک ذخیره ای پروتیین در بذر جو در ابتدای ناحیه رمزکننده قرار گرفت. پس از دریافت قطعه سنتزی در ناقل pUC57Hvorhegf، آن قطعه توسط آنزیم های SacI و HindIII از ناقل جدا و در پلاسمید pBI121 همسانه سازی شد. در گام بعدی همسانه سازی، برای درج توالی ژن موردنظر در ناقل pGH215، به دلیل نبود جایگاه های شناسایی یکسان در این ناقل ها، از ناقل حدواسط pBI121Gus-12 استفاده شد. بعد از برش ناقل همسانه سازی و pBI121Gus-12 توسط آنزیم های SacI و KpnI، همسانه سازی قطعه موردنظر در pBI121Gus-12 انجام گرفت. در گام آخر، ناقل pBI121G-12Hvorhegf و pGH215 با آنزیم های KpnI و SalI هضم شده و توالی موردنظر در مرز راست T-DNA و قبل از پایان دهنده NOS قرار گرفت.

با استفاده از آزمون کلونی پی سی آر، الگوی هضم آنزیمی و توالی یابی با آغازگرهای رفت وبرگشت، درستی همسانه سازی و تولید ناقل های pBI121Hvorhegf واجد ژن hegf با نشانگر کانامایسین و pGH215Hvorhegf واجد ژن hegf با نشانگر هیگرومایسین، مناسب برای انتقال ژن در تک لپه ای ها تایید شد.

 ناقل بیانی نوترکیب pGH215 تغییریافته دارای کاست ژنی موردنظر همراه با نشانگر هیگرومایسین می تواند برای انتقال ژن موردنظر در تک لپه ای ها و بیان پروتیین نوترکیب در اندام ذخیره ای بذر استفاده شود.