بهینه سازی تخلیص پروتئین نوترکیب خارج غشایی (OMP) باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات

پروتیین خارج غشایی omp در سطح خارجی پیکره باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات (Candidatus Liberibacter asiaticus) وجود دارد. پروتیین مذکور می تواند به عنوان آنتی ژن برای تولید انواع آنتی بادی های مونوکلونال و پلی کلونال مورد استفاده قرار گیرد. با این حال خالص سازی پروتیین های غشایی به دلیل وجود ساختارهای آب گریز با مشکلات فراوانی همراه می باشد. در این راستا، هدف از اجرای پژوهش حاضر، بهینه سازی استحصال و تخلیص پروتیین نوترکیب omp می باشد.

از سازه بیانی باکتریایی pET28a حاوی ژن omp برای تولید نوترکیب این پروتیین استفاده شد. بیان ژن  omp در سویه Rosetta باکتری  E. coli صورت پذیرفت. با توجه به آبگریز بودن پروتیین omp، خالص سازی آن در شرایط واسرشته  مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور از غلظت های مختلف سدیم کلراید، اوره و گوانیدین هیدروکلراید در شرایط اسیدی pH  متفاوت استفاده گردید. به منظور دستیابی به پروتیین کاملا خالص نوترکیب، استحصال پروتیین از ژل پلی آکریل آمید با روش های مبتنی بر سونیکاسیون، شستشوی توسط انتشار و الکتروالوشن صورت پذیرفت. بررسی کمیت و کیفیت پروتیین های خالص شده با انجام الکتروفورز SDS-PAGE و محاسبه غلظت پروتیین با نرم افزار ImageJ  انجام گرفت. همچنین برای تایید ماهیت پروتیین خالص شده، آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی صورت پذیرفت.

نتایج اولیه نشان داد که استفاده از غلظت 500 میلی مولار سدیم کلراید به عنوان یک جزء ضروری در بافرهای استخراج می باشد. همچنین استفاده از اوره به عنوان عامل دناتوره کننده کارایی دو برابری نسبت به گوانیدین هیدروکلراید در میزان پروتیین تخلیص شده داشت و بدین ترتیب بیشترین میزان پروتیین (450 میکروگرم در میلی لیتر) زمانی بدست آمد که غلظت 8 مولار اوره در اجزای بافری تخلیص گنجانده شد. علاوه بر این، نتایج مربوط به جداسازی باند پروتیین از ژل نشان داد که روش الکتروالوشن بهترین کارایی را در بازیابی و جداسازی پروتیین هدف از ماتریکس ژل در مقایسه با روش سونیکاسیون و شستشوی توسط انتشار داشت. نتایج آزمون الکتروفورز پروتیین حاکی از وجود یک پروتیین با اندازه 34 کیلو دالتون متناسب با وزن مولکولی پروتیین omp می باشد. آزمون وسترن بلات نیز موید ماهیت پروتیین نوترکیب در ممبران بود.

مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از اوره با غلظت 8 مولار، نمک سدیم کلراید با غلظت 500 میلی مولار به همراه تنظیم بافر الوشن روی (4) pH در مرحله تخلیص پروتیین می تواند به عنوان یک شرایط بهینه برای بدست آوردن بیشترین مقدار پروتیین هدف بکار رود.  همچنین، روش الکتروالوشن به عنوان روش کارآمد جهت استحصال باند پروتیینی از روی ژل آکریل آمید معرفی شد.