پارامترهای فیزیکی و بیولوژیکی موثر در ایجاد گیاهان ترانسپلاستوم توتون به روش بمباران ذره ای توسط PDS-1000/He

بهینه سازی پارامترهای موثر در روش بمباران ذره ای برای انتقال DNA به کلروپلاست با کارایی بالا و بدون آسیب به بافت یک نیاز ضروری در ایجاد گیاهان ترانسپلاستوم می باشد. با توجه به تشابه نسبی موانع فیزیکی بر سر راه ورود ریزذرات به هسته و کلروپلاست معمولا از ژن گزارشگر هسته ای gus استفاده می شود، ولی پارامترهای فیزیکی و بیولوژیکی درگیر در تراریختی پلاست ها بطور مستقیم گزارش نشده اند. در این تحقیق برای بهینه سازی انتقال ژن به کلروپلاست توتون پارامترهای نوع ریزذرات، غلظت DNA، فشار هلیوم شتاب دهنده، آرایش برگ، فاصله شلیک و مدت زمان پیش تیمار ریزنمونه ها قبل از بمباران بررسی شد. پس از انتقال ناقل کلروپلاستی به ریزنمونه های برگی، باززایی گیاهان ترانسپلاستوم در محیط گزینش حاوی mg/l 500 اسپکتینومایسین انجام شد. بیشترین تعداد ترانسپلاستوم (2.5 گیاه به ازای هر بمباران) از واحد آزمایشی شلیک شده با ریزذرات تنگستن با قطر μm 0.7، مقدار DNA μg 1، فشار هلیوم شتاب دهنده psi 1100، فاصله شلیک 6 سانتی متر و دوره پیش تیمار 24 ساعت حاصل شد، و این پارامترها به عنوان دستورالعمل کارآمد تراریختی کلروپلاستی معرفی می شود. گیاهان هموپلاسم پس از سه دوره باززایی در حضور آنتی بیوتیک های استرپتو/اسپکتینومایسین بدست آمدند. تایید مولکولی درج کاست بیانی در محل دقیق ژنوم و تایید هموپلاسمی با استفاده از آنالیز PCR و لکه گذاری سادرن انجام شد. گیاهچه های سبز و آلبینوی حاصل از جوانه زنی بذور تولید شده از تلاقی متقابل بین گیاهان توتون شاهد و ترانسپلاستوم، توارث مادری ژن های انتقالی به کلروپلاست را تایید کرد.