ساخت سازه ژنی pCDNA3.1-AopB به عنوان مدل واکسن DNA علیه Aeromonas hydrophila در کپورماهیان

باکتری Aeromonas hydrophila یکی از مهم ترین باکتری های بیماری زای ماهی است که سبب سپتی سمی هموراژیک، آب آوردگی محوطه شکمی و مرگ و میر در سنین متفاوت و در گونه های مختلف ماهی به ویژه کپورماهیان می شود. ایمن سازی یکی از روش های مناسب برای پیشگیری از این بیماری است. استفاده از سازه های ژنی حاوی آنتی ژن های اختصاصی باکتری ها در سال های اخیر به منظور توسعه واکسن هایی با کارایی بالا و استفاده در روش های آسان تر مانند تجویز خوراکی در آبزی پروری توسعه یافته است. در مطالعه حاضر، پروتیین aopB سیستم ترشحی تیپ III باکتری A. hydrophila جدا شده از کپورماهیان استان خوزستان به منظور طراحی یک سازه ژنی مدل واکسن DNA در پلاسمید یوکاریوتی بیانی pCDNA3.1 همسانه سازی شد. در این پژوهش از جدایه باکتری A. hydrophila که از ماهیان کپور مبتلا به سپتی سمی آیروموناسی در مزارع پرورشی استان خوزستان جداسازی و با روش مولکولی و فنوتیپی تایید شده بودند، استفاده شد. توالی ژن aopB از بانک ژن NCBI استخراج و ناحیه کد کننده ژن با استفاده از آغازگرهای حاوی نواحی برش آنزیم های EcoRI و NheI تکثیر شد. سپس محصول PCR در پلاسمید بیانی یوکاریوتی pCDNA3.1-HisA الحاق و با استفاده از شوک حرارتی به باکتری TOP10-F' انتقال داده شد. پس از غربالگری کلون های مثبت با استفاده از کلونی PCR و تعیین توالی، سازه ژنی pCDNA3.1-AopB با استفاده از روش الکتروپوراسیون به سلول های CHO منتقل و بیان پروتیین نوترکیب با استفاده از روش وسترن بلات در لیز سلولی ارزیابی شد. نتایج PCR و تعیین توالی سازه ژنی نشان دهنده همسانه سازی ژن aopB به طول تقریبی 1000 جفت باز در پلاسمید pCDNA3.1-HisA بود. آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی ضد HisTag وجود یک پروتیین با وزن مولکولی حدود 36 کیلودالتون را نشان داد. در مجموع، سازه ژنی pCDNA3.1-AopB حاوی ژن aopB طراحی و مورد تایید قرار گرفت. از این سازه ژنی می توان در مطالعات بالینی به منظور بررسی ایمنی زایی در کپورماهیان در بیماری زایی تجربی با A. hydrophila استفاده کرد.