تشخیص بیماری پبرین در کرم ابریشم با استفاده از روش های مولکولی

از آنجایی که بیماری پبرین به عنوان مهم ترین و خطرناک ترین بیماری کرم ابریشم به صورت افقی از طریق اسپور و به صورت عمودی از طریق تخم گسترش می یابد، مبارزه با این بیماری و حذف کامل آن از تولیدات دامی با مشکلات زیادی همراه بوده است. هدف از این پروژه شناسایی مولکولی عامل بیماری پبرین در کرم ابریشم با استفاده از روشی حساس، اختصاصی و دقیق بود. بنابراین، یک قطعه 136 جفت باز بر اساس توالی SSU rDNA نوزما بامبیسیس انتخاب و یک جفت پرایمر طراحی شد. سپس با استفاده از روش PCR معمولی قطعه هدف تکثیر و توالی یابی شد. پس از آن، برای تعیین حد تشخیص، با استفاده از روش Real-Time PCR، رقت های سریالی 5 برابری از DNA نوزما بامبیسیس. تهیه شد و آخرین رقت که سیگنال فلورسنت تولید می کرد، به عنوان حداقل حد تشخیص در نظر گرفته شد. تمامی تست ها با دوتکرارانجام شد. بر اساس نتایج آزمون حساسیت، از منحنی استاندارد شامل مقادیر Ct و غلظت DNA برای آنالیز استفاده شد. همچنین 80 نمونه مشکوک که با میکروسکوپ نوری بررسی شده بودند، با استفاده از PCR معمولی و Real-Time PCR نیز مورد ارزیابی قرار گرفتند. هر دو روش PCR هیچ تکثیری را برای نمونه های کنترل منفی نشان ندادند. یافته ها نشان داد که کمترین حد تشخیص برای نوزما بامبیسیس کمتر از 6 pg DNA بود. در حالی که این مقدار برای PCR معمولی 8 نانوگرم بود. از 80 نمونه بررسی شده، 55، 60 و 62 نمونه به ترتیب برای روش های میکروسکوپ نوری، PCR معمولی و Real-Time PCR مثبت بودند. یافته ها حاکی از آن است که روش Real-Time PCR نسبت به روش PCR معمولی توانایی بالاتری در تشخیص عامل بیماری پبرین دارد و هر دو روش PCR نسبت به میکروسکوپ نوری برتری دارند. بنابراین با توجه به مراحل کمتر و دقت بالاتر Real-Time PCR می توان آن را به عنوان روشی مناسب برای تشخیص بیماری پبرین معرفی کرد.