طراحی و بررسی کارایی کیت الایزا مبتنی بر آنتی بادی تولید شده علیه پروتئین پوششی ویروس ساقه شیاری سیب در Escherichia coli

تولید آنتی بادی و کاربرد آن در آزمون های متنوع و طراحی بیوسنسورها یکی از راهبردهای مهم در تشخیص ویروس های گیاهی است. ویروس ساقه شیاری سیب (Apple stem grooving virus (ASGV)) یکی از ویروس های مهم درختان دانه دار و سیب می-باشد. هدف از این تحقیق، بیان ژن پروتیین پوششی این ویروس در E. coli و تولید آنتی بادی علیه پروتیین بیان شده و ارزیابی آن در آزمون های تشخیصی است.

در واکنش زنجیره ای پلی مراز، قطعه ای به طول 714 جفت باز مربوط به ژن کامل پروتیین پوششی ASGV تکثیر و در پلاسمید pTG19 همسانه سازی شد. سپس، قطعه مورد نظر با آنزیم های برشی BamHI و EcoRI خارج و در حامل بیانی pET28a (+) همسانه سازی شد و سازه مورد نظر به منظور بیان ژن هدف، به باکتری E. coli سویه BL21 (DE3) منتقل شد. بهینه سازی بیان در غلظت یک میلی مولار IPTG و زمان های سه، چهار، شش و 16 ساعت پس از القا صورت گرفت و تایید بیان پس از الکتروفورز عمودی و آزمون وسترن بلات انجام شد. پروتیین بیان شده تخلیص و به عنوان آنتی ژن به خرگوش تزریق شد. پس از ایمن سازی سرم، ایمنوگلوبولین ها از سرم خون تخلیص و بخشی از آنها برای تولید کانجوگیت استفاده شدند. در نهایت، کارایی آنها در آزمون های سرولوژیکی ارزیابی شد.

نتایج تعیین توالی یابی نشان داد قطعات تکثیر یافته در پی سی آر مربوط به ژن پروتیین پوششی ویروس ساقه شیاری سیب است. نتایج پی سی آر کلونی و هضم آنزیمی تایید کننده ساخت سازه pET28-ASGV-CP بود. تعیین توالی سازه ساخته شده در دو جهت حاکی از قرار گرفتن ژن پروتیین پوششی در قاب صحیح درون پلاسمید بیان و فقدان جهش نوکلیوتیدی بود. پس از بهینه سازی، بیان و استخراج پروتیین پوششی، نوار پروتیینی با اندازه تقریبی 27 کیلودالتون چهار ساعت بعد از القاء در الکتروفورز عمودی و وسترن بلات تایید شد. در الایزی مستقیم، غیر مستقیم و آزمون دیبا، نتایج نشان داد غلظت حدود 1:1000 آنتی بادی تخلیص شده در غلظت مناسب آنتی ژن توانایی واکنش مناسب با آنتی ژن را دارد.

آنتی بادی تولید شده و کانژوگه شده در رقت مناسب در تناسب با غلظت آنتی ژن توانایی اختصاصیت و کارایی لازم برای ردیابی و شناسایی ویروس ساقه شیاری سیب را بخوبی دارد. یکی از کاربردهای این آنتی بادی در طراحی انواع کیت های تشخیصی سرولوژیکی مانند الایزا است.