بهینه سازی استخراج اسید نوکلئیک از سیکلامن ایرانی (Cyclamen coum Miller)

سیکلامن هم به عنوان گیاه زینتی و هم دارویی شناخته شده است. عصاره این گیاه، فعالیت زیستی قوی و محتوای پلی فنولی، تانن و پروتئین بالا دارد. به دلیل وجود این ترکیبات بازدارنده، استخراج اسیدهای نوکلئیک از گیاه دشوار است. بیشتر آزمون های زیستی با استخراج DNA و RNA آغاز می شود. بنابراین، انتخاب یک روش استخراج مناسب، قابل اعتماد و تکرارپذیر، اهمیت زیادی دارد. در این آزمایش، بهینه سازی استخراج اسیدهای نوکلئیک از گیاه سیکلامن ایرانی (Cyclamen coum Miller) و امکان بیان ژن های خانه دار مناسب در این گونه،  ارزیابی شد. پس از جمع آوری نمونه های گیاهی از سه اندام برگ، گلبرگ و هیپوکوتیل، برای استخراج DNA روش های تغییریافته CTAB و SDS و برای استخراج RNA روش های Trizol تغییریافته، CTAB-LiCl و RNX-Plus، استفاده  شد. کیفیت و کمیت DNA و RNA استخراج شده از راه الکتروفورز، اسپکتروفتومتری و PCR بررسی شد. برای تایید کیفیت DNA استخراج شده وجود قطعات ژن های 18S ریبوزومی، اکتین (ACT)، توبولین (TUB) و فاکتور طویل سازی (EF-1a) به عنوان ژن خانه دار با کمک PCR بررسی  شد. بر اساس نتایج به دست آمده، کمترین غلظت DNA در روش CTAB تغییریافته مشاهده شد. غلظت و کیفیت DNA نمونه های برگ، گلبرگ و هیپوکوتیل در روش SDS تغییریافته بهتر از روش CTAB بود. مقایسه سه روش Trizol تغییریافته، CTAB-LiCl و RNX-Plus در استخراج RNA، نشان داد که روش Trizol تغییریافته از لحاظ وضوح نوارها و غلظت RNA استخراج شده بهتر از دیگر روش ها بود. با استفاده از این پروتکل، نسبت جذب A260/280 نانومتر از 01/2 تا 10/2 متغیر بود که نشان دهنده کیفیت بالای RNA جدا شده بدون آلودگی فنولی یا پروتئینی است. علاوه بر این، نسبت A260/A230 نانومتر بین 99/1 و 15/2 بود که نشان می دهد RNA استخراج شده بدون پلی ساکارید است. ساخت cDNA از RNA استخراج شده از سه بافت سیکلامن ایرانی تنها در دو روش Trizol و RNX-Plus با موفقیت انجام شد. برای بررسی کیفیت نمونه های RNA، امکان بیان ژن های خانه دار با استفاده از RT-PCR ارزیابی شد. نتایج RT-PCR نشان داد که در بین ژن های خانه دار، TUB و 18S در همه نمونه های برگ، گلبرگ و هیپوکوتیل سیکلامن ایرانی از وضوح باند بیشتر و کیفیت بالاتری برخوردار بودند.