بهینه سازی شرایط انجام RT-PCR به منظور ارزیابی بیان ژن های پراکسیزومی کاتالاز و PEX3 در مقایسه با ژن های پرتوانی Nanog و Oct4 در سلول های بنیادی

پراکسیزوم ها اندامک هایی هستند که در تمام یوکاریوت ها یافت می شوند و در متابولیسم اسیدهای چرب و دیگر متابولیت ها شرکت دارند. به منظور بررسی نیمرخ بیان دو ژن پراکسیزومی (کاتالاز و PEX3) در طول عصب زایی، به بررسی نیمه کمی بیان این دو ژن در مقایسه با شاخص های ژنی سلول های بنیادی (Oct4 و Nanog) در سلول های P19 پرداختیم. در این تحقیق، ما از سلول های P19 استفاده کردیم که سلول های مناسبی برای مطالعات عصب زایی هستند. به علاوه، دو ژن متفاوت پراکسیزومی برای تعقیب کینتیک ساخت پروتئین ماتریکس پراکسیزومی (کاتالاز) و نیز ساخت پروتئین های غشائی پراکسیزومی (Pex3p) انتخاب شدند. ابتدا RNA از سلول های P19 استخراج و بعد، از آن برای ساخت cDNA استفاده شد. پرایمرهای اختصاصی برای cDNA مربوط به Oct4، Nanog، PEX3 و کاتالاز توسط RT-PCR، برای بررسی کمی، تکثیر شدند. پارامترهای مختلفی جهت بهینه سازی شرایط PCR برای هر ژن، تغییر یافت. نمونه ای از شرایط مطالعه به این صورت است: نوار مربوط به ژن PEX3 پس از 35 چرخه RT-PCR و در دمایی بین 5/52 تا 1/55 درجه سانتی گراد، به صورت مشخص دیده شد، در حالی که در RT- PCR نوار مشخص کاتالاز پس از 30 چرخه و در محدوده دمایی بین 7/52 تا 55 درجه سانتی گراد دیده شد. cDNA مربوط به Nanog پس از 36 چرخه و در دمای اتصالی بین 1/60 تا 1/64 درجه سانتی گراد تکثیر یافت و نوار مربوط به RT-PCR ژن Oct4 پس از 28 چرخه و در محدوده دمایی بین 4/53 تا 57 درجه سانتی گراد دیده شد. به علاوه، تفاوت میان شدت فلوئورسانت هر نوار به منظور بررسی تفاوت بیان ژن های ذکرشده در سلول های P19 مقایسه شد.