بررسی خصوصیات ایمنی زایی پروتئین نوترکیب زنجیره سبک سم بوتولینوم تیپ (840) A

سم بوتولینوم تیپ A به لحاظ ساختاری از یک زنجیره سبک به وزن 50 کیلودالتون و یک زنجیره سنگین به وزن 100 کیلو دالتون تشکیل شده است که توسط یک باند دی سولفید به هم متصل شده اند. این پروتئین شامل سه بخش (Domain) است که بخش زنجیره سبک آن دارای فعالیت آنزیمی می باشد. در این پژوهش، هدف ما از تولید نوترکیب بخش عملکردی به دست آوردن یک پروتئین مناسب جهت بررسی ایمنی زایی آن است.
باکتری در شرایط بی هوازی رشد داده شد سپس DNA کروموزومی به روش قلیایی استخراج گردید. پس از بررسی ترادف ژن مربوطه و طراحی پرایمر قطعه مورد نظر از طریق واکنش های زنجیره ای پلیمرازی (PCR) فراوان سازی شد. محصول PCR بر روی سه ناقل بیانیpRSETA، pET28a و pET32a همسانه سازی گردید. پروتئین حاصل از بیان توسط SDS-PAGE بررسی و صحت محصول با روش وسترن بلاتینگ و واکنش الیزا مورد تایید نهایی قرار گرفت و سپس به وسیله کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص سازی شد، ایمنی زایی بر روی موش سوری در سه مرحله صورت گرفت و نتایج آن مورد بررسی قرار گرفت.
در این تحقیق بالاترین بیان در شرایط غلظت 0.5 میلی مولار IPTG، جذب نوری 0.6 و زمان القای 15 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد به دست آمد. پروتئین بیان شده توسط ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص سازی گردید. آنتی بادی حاصل از تزریق پروتئین نوترکیب توانست مانع از مرگ موش ها در دوز LD50 100 شود.
هر چند بیان ژن هایی با درصد بالایی از AT در سیستم Ecoli ضعیف می باشد ولی ما در این تحقیق توانستیم بیان مناسبی به دست آوریم. تخلیص پروتئین نوترکیب در مراحل اولیه به دلیل اتصال ضعیف هیستیدین انتهایی به ستون دشوار بوده که با تغییر در روش ها این پروتئین تا 90 درصد خالص سازی شد. در بحث ایمنی زایی پروتئین نوترکیب مورد نظر نیز مشخص شد که آنتی بادی های تولید شده در مقایسه با آنتی بادی تولید شده علیه بخش اتصال دهنده از ایمنی زایی پایینی برخوردار است.