بهینه سازی شرایط کشت باکتری متعهد BL21 جهت تولید پروتئین نوترکیب PEP

پس از گذر از تحقیقات ژنومی و وجود انبوهی از اطلاعات در بانک های ژنومی اینک دوران تحقیقات در زمینه پساژنومی و شناخت محصولات ژنها، چگونگی ارتباطات آنها با یکدیگر و شناخت مسیرهای داخل سلولی با ابزار توانمند پروتئومیکس است. هدف از این بررسی بهینه سازی شرایط لازم جهت تولید پروتئین نوترکیب پراکسیزومی موشی (PEP) در سویه مناسب و مستعد شده از اشرشیاکلی به نام BL21 میباشد. پروتئین نوترکیب PEPدر مراحل بعد خالص شده و به عنوان بخشی از مطالعات پروتئومیکسی برای شناسایی اجزاء سلولی واکنش دهنده با آن به کار خواهد رفت. در این بررسی وکتور بیانی پروکاریوتی (pGEX6P2) که در آن cDNA PEP در مجاورت توالی کد کننده GST (گلوتاتیون ترانسفراز) قرار داده شده است، استفاده شد. سلول های باکتریایی سویه BL21 بوسیله این وکتور بیانی ترانسفورم شدند. برای به دست آوردن بالاترین میزان بیان و حلالیت پروتئین، کشت سلولهای باکتریایی در محدوده دمایی 37-20 سانتی گراد ارزیابی شد. همچنین غلظت مناسب IPTG برای القاء بیان با بررسی محدوده 1/0تا10 میلی مولار صورت گرفت. پس از به دست آوردن بالاترین میزان بیان در گام بعدی لازم است پروتئین های درون سلولی آزاد شوند، بنابراین با استفاده از امواج اولتراسوند با قدرت ها و در زمان های متفاوت سلول ها لیز و سپس با افزودن شوینده NP40 یا Triton X-100 در غلظت های مختلف، پروتئین های محلول باکتریایی و پروتئین نوترکیب بیان شده، آزاد شدند. بهینه ترین حالت برای بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب PEP در دمای °C20 و غلظت μg/ml0.1 از IPTG به دست آمد. همچنین تفاوتی در بکارگیری TritonX100 یا NP40 به عنوان شوینده های حلال غشایی به دست نیامد. هر چند که بهترین غلظت برای شوینده % 1 (حجمی/حجمی) مشخص شد.