ترانسفکشن رده سلولی PC12 بوسیله وکتور بیانی -NT4 pEGFPNIو بررسی بیان پروتئینی آن

یکی از تکنیک های پایه ای مهم برای مطالعه یک پروتئین اختصاصی در بیولوژی مولکولی، کلون کردن و بیان آن در سلول می باشد. از جمله روش های منتقل کردن ژن، روش های غیر ویروسی است که کم هزینه تر، آسانتر و ایمنتر می باشند. یکی از ژن های مهم که کاربردهای بالینی فراوانی دارد ژن NT4 است. این ژن یکی از اعضای خانواده نوروتروفیک است و در سلول های گلیال سیستم اعصاب محیطی و مرکزی بیان می شود. این نوروتروفین در بیان ژنی، بقا و تمایز رده های مختلف نورونی شرکت دارد. هدف از انجام این پژوهش، ساب کلونینگ و ترانسفکت این ژن به منظور مطالعه و دسترسی بیشتر با توجه به نیاز به این فاکتور نوروتروفیک در فعالیتهای ژن درمانی است.
در این تحقیق، ژن NT4 با روش PCR در پلاسمید pCMV-SPORT6کلون گشته و پس از آن در باکتری اشرشیاکلی سوش DH5-α ترانسفورم شد. پلاسمید نوترکیب از باکتری میزبان استخراج و ژنNT4 با استفاده از آنزیم Not I، Sal Iاز پلاسمید جدا گردید. در مرحله بعد پلاسمید برای پذیرش قطعه NT4 و انجام کلونینگ با آنزیم Hind III برش داده شد و ژن NT4 درون پلاسمید pEGFP-NI ساب کلون شد. محصول واکنش اتصال در باکتری فوق ترانسفورم و در محیط LB حاوی آمپی سیلین کشت داده شد. پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، از باکتری تخلیص و در مرحله بعد در سلول PC12 ترانسفکت گردید و در خاتمه بیان پلاسمید نوترکیبب با روشSDS PAGE، western blotting مورد بررسی قرار گرفت.
آنالیز آنزیمی و تعیین توالی نشان داد پلاسمید ژن مورد نظر حاوی توالی صحیحی بوده و تطابق کامل با توالی ژن مورد نظر در بانک ژن دارد. در آنالیز پروتئین های جدا شده از سلول های ترانسفکت شده با روش SDS-PAGE، باندی حدود 45 کیلودالتون مشاهده شد که با آنتی بادی مونوکلونال در آنالیز وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت.
این پلاسمید به دلیل ساختار صحیح، جهت انتقال به سیستم یوکاریوتی و ارزیابی بیان مناسب می باشد.