بیان و تخلیص DNA پلیمراز Pfu متعلق به خانواده ی B

DNA پلیمرازها آنزیم هایی هستند که سنتز مولکول DNA را از دئوکسی ریبونوکئوتیدها بر عهده دارند. این آنزیم ها ابزارهای ضروری در زیست شناسی مولکولی به حساب می آیند. DNA پلیمراز Pfu از یک آرکئوباکتری گرمادوست که در رسوبات دریایی با دمای 100-90 درجه ی سلسیوس زندگی می کند، جدا گردیده است. این آنزیم، خصوصیت اگزونوکلئازی 3 به 5 را دارد که باعث اصلاح خطاهای ناشی از همانندسازی DNA می شود.

در این مطالعه، قطعه ی کد کننده ی ژن DNA پلیمراز Pfu در ناقل بیانی b15-pET کلون گردید. سپس با تغییر شرایط بیان مانند غلظت IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)، زمان و دمای القا، بیان این آنزیم بهینه شد. در نهایت در شرایط بهینه، پروتئین در مقیاس بالا تهیه و به روشی ساده تخلیص گردید. سپس آنزیم تخلیص شده، جهت بررسی فعالیت در واکنش PCR (Polymerase chain reaction) به کارگرفته شد.

کلونی هایی بعد از ترانسفورماسیون پلاسمید نوترکیب ایجاد شد که اکثر آن ها حاوی پلاسمید بودند. بیان آنزیم Pfu باندی را در حدود KD 90 در ژل الکتروفورز SDS-PAGE (Sodium do decyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis) نتیجه داد. بیشترین میزان تولید پروتئین با غلظت 75/0 میلی مولار ماده ی القا کننده ی IPTG، دمای 37 درجه ی سلسیوس و 3 ساعت پس از القا مشاهده شد.

تخلیص پروتئین با به کارگیری روشی جدید بر مبنای پروتکل Desai منجر به ایجاد محصولی شد که در واکنش PCR فعالیتی مشابه با نمونه ی تجاری داشت.