کلونینگ، بیان و ارزیابی فعالیت اگزوتوکسین A نوترکیب سودوموناس آئروژینوزا

امروزه در بسیاری از مطالعات مربوط به درمان سرطا ن های مختلف، از هدفمند نمودن ترکیبات سمی علیه سلول های سرطانی استفاده می شود. یکی از این ترکیبات بسیار موثر، اگزوتوکسین A سودوموناس می باشد. هدف از این مطالعه، بررسی بیان و تخلیص و ارزیابی فرم کوتاه شده ای از این توکسین در سیستم بیانی پروکاریوتی بود.
در ابتدا توالی فرم کوتاه شده ی توکسین (38PE) با استفاده از پرایمرهای دارای جایگاه برش آنزیمی HindIII و NdeI از روی وکتور 57-pUC حاوی این ژن تکثیر شد. بعد از برش آنزیمی، داخل وکتور b26-pET خطی شده با این آنزیم های برشی کلون گردید. ارزیابی و تایید ساختار وکتور نوترکیب به وسیله ی هضم آنزیمی و تعیین توالی، مورد بررسی قرار گرفت. وکتور نوترکیب به داخل باکتری های (3DE)21BL، plysS(3DE)21BL و Rosetta ترانسفورم شد و بعد از بیان و تخلیص توکسین، ارزیابی عملکرد آن در سلول های یوکاریوتی HUVEC و KDR293 انجام شد.
توالی ژن توکسین با موفقیت تکثیر گردید و با هضم آنزیمی و تعیین توالی صحت کلونینگ اثبات گردید. وکتور نوترکیب در E.coli (Escherichia coli) بیان و به وسیله ی توالی هیستیدینی با موفقیت تخلیص گردید. در نهایت، توکسیسیتی توکسین تخلیص شده توسط آزمایش MTT (bromide diphenyltetrazolium-5،2-(yl-2-Dimethylthiazol-5،4)-3) بر روی دو رده ی سلول یوکاریوتی KDR293 و HUVEC مورد بررسی قرار گرفت.
با توجه به ساخت موفقیت آمیز وکتور نوترکیب 38PE-b26-pET و ترانسفورم آن به داخل سلول های پروکاریوتی، میزان بیان در سلول های مختلف E.coli متفاوت بود؛ به گونه ای که میزان بیان آن در (3DE)21BL بیشتر بود. از آن جایی که قسمت اتصالی توکسین در فرم کوتاه شده وجود ندارد، بنابراین در ارزیابی سلولی بر اساس مطالعه ی قبلی، دوز کشندگی آن بیش از هزار برابر بیشتر از نوع هدفمند شده ی آن با عامل رشد عروقی 121VEGF می باشد.