کلون و بیان فوتوپروتئین اکورین با استفاده از دنباله اینتئین

اینتئین (INT) بخش های درونی پروتئین است که می تواند در طی فرایند پیرایش پروتئین، خود را از پروتئین نابالغ جداکند. این توالی برای جدا شدن، احتیاج به آنزیم یا کوفاکتور خاصی ندارد. از این توالی پروتئینی و ویژگی برش خود به خودی آن، در اثر اعمال تغییر دما، pH و یا القای تیولی در جهت تخلیص پروتئین استفاده می شود. مزیت این روش نسبت به بقیه روش های تخلیص پروتئین، عدم احتیاج به آنزیم های پروتئازی و مراحل حذف پروتئاز می باشد که این روش را از لحاظ اقتصادی حائز اهمیت می کند. در تحقیق حاضر فوتوپروتئین اکورین به صورت ملکولی با INT هیبرید شده و میزان بیان آن مورد ارزیابی قرار گرفته است.
در این تحقیق ژن رمز کننده اکورین که در مطالعات قبلی درون وکتور pET21a کلون شده بود با استفاده از پرایمرها و آنزیم های محدودگر اختصاصی درون وکتور pTYB21، که حاوی دنباله INT است، کلون گردید. سپس وکتور pTY-aequorin حاصله به باکتری E.coli سویه بیانی ER2566 انتقال داده شد و با تکنیک های الکتروفورز (Electerophoresis)، وسترن بلات (Western Blot) و تعیین ترادف (Sequencing)، صحت کلون ها بررسی گردید.
ژن به رمز درآورنده فوتوپروتئین اکورین بین جایگاه های آنزیمی SapI و PstI درون وکتور pTYB21 به صورت صحیح کلون گردید و بیان پروتئین هیبریدی اکورین- اینتئین با استفاده از روش های مرسوم تایید گردید.
ساخت سازه ژنی فوتوپروتئین اکورین، در حالت هیبریدی و متصل به INT با استفاده از روش های ملکولی تایید شد. همچنین میزان بیان اکورین در حالت متصل شده با INT، درصد بیان بیش از 25 درصد مجموعه پروتئین های سلولی را نشان می دهد.