کلونینگ و تولید نوترکیب آنزیم گرانزیم M انسانی

گرانزیم M یکی از اعضای خانواده ی سرین پروتئازهاست که درلنفوسیت های T سیتوتوکسیک و سلول های NK بیان می شود. گرانزیم M یک القاکننده ی آپوپتوز در سلول های توموری هدف می باشد. بنابراین با توجه به اهمیت گرانزیم M در آپوپتوز، هدف از این تحقیق تولید آنزیم فعال به لحاظ زیستی می باشد.

قطعهcDNA مربوط به گرانزیم M فعال به درون ناقل بیانی pET21a(+) کلون و ناقل نوترکیب جهت بیان پروتئین، به سلول های مستعد با روش شوک حرارتی منتقل گردید. جهت بیان بالای پروتئین، شرایط القا بهینه گردید و سپس آنالیز پروتئین توسط SDS-PAGE انجام گرفت. سپس انکلوژن بادی های تولیدی در بافر حاوی اوره 8 مولار حل شده و با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل-آگارز خالص شد. فعالیت پروتئازی گرانزیم M با استفاده از سوبسترای کازئین و با روش اسپکتروفتومتری (طیف سنجی) سنجیده شد.

گرانزیم M نوترکیب در باکتری E. coli به صورت انکلوژن بادی تولید شد و بهترین سطح بیان در دمای 22 درجه ی با غلظت 1 میلی مولار از IPTG در طول 5 ساعت است. با استفاده از ستون نیکل- آگارز و شیب غلظت اوره، گرانزیم M به طور همزمان با تاخوردن، خالص گردید. نتایج حاصل از تعیین فعالیت نشان داد که آنزیم در حضور سوبسترای کازئین فعال بوده و فعالیت ویژه اش 71 واحد بر میلی گرم است. فعال بودن گرانزیم M نشان دهنده ی این بود که آنزیم تاخوردگی درستی پیدا کرده است.

با توجه با اینکه گرانزیم M می تواند هدفی بالقوه برای داروهای ضد سرطان باشد، بنابراین روش پیشنهادی در این تحقیق می تواند تسهیل کننده مطالعه بیشتر بر روی این آنزیم باشد.