ایجاد پلاک توسط سویه V4ویروس عامل بیماری نیوکاسل بر روی کشت سلولی و بررسی مولکولی با روش واکنش زنجیره پلیمراز نسخه برداری معکوس (RT-PCR)

امروزه در بسیاری از کشورهای دنیا واکسن کلون شده مورد استفاده قرار می گیرد. جهت کلون کردن یک ویروس، یکی از راه ها رشد ویروس بر روی کشت سلول و جدا کردن پلاک های مجزا و متفاوت و بررسی آنها از لحاظ مورفولوژی و ژنتیکی است.
دراین تحقیق، ابتدا سلول های ) Madin-Darby Canine Kidney MDCK) بصورت تک لایه و بطور استاندارد کشت داده شد. رقت های مختلف ویروس به سلول های تک لایه MDCK همراه با تریپسین، آگار و سولفات منبزیوم اضافه شد. ویروس توانست بر روی سلول های فوق تکثیر و ایجاد اثر سایتوپاتیک (CPE) و پلاک نماید. در رقت 6-10 تعداد 6 پلاک که از لحاظ شکل و اندازه تفاوت داشتند برداشته شدند و جهت تکثیر به تخم مرغ جنین دار 11-9 روزه تلقیح گردید. بعد از 48 ساعت مایع آلانتوئیک هر تخم مرغ حاوی پلاک برداشت ونسبت به جداسازی RNA هر پلاک اقدام گردید. منطقه شکست (Cleavage site)پروتئین ادغامی(Fusion) با تست RT-PCR انجام شد و محصول PCR خالص سازی وسکانس گردید. سکانس نوکلئوتیدها و آمینواسیدها برای هر پلاک با سوش های ثبت شده در بانک ژنی مقایسه شد. سکانس نوکلئوتیدهای تمامی پلاک های بدست آمده، 97 تا 99% همخوانی با ویروس V4در بانک ژنی را تایید نمود. هدف از این پژوهش ایجاد پلاک از سوش V4 ویروس نیوکاسل بر روی سلول های MDCK جهت ایجاد پلاک های مجزا و در نهایت بررسی مولکولی پلاک های ایجاد شده می باشد.