بیان هترولوگ آنزیم کیتیناز 36 کیلو دالتونی از قارچ Trichoderma atroviride در میزبان پروکاریوتی

آنزیم های کیتینولیتیک در تجزیه پسماندهای کیتینی نظیر پوسته سخت پوستان و دیواره سلولی قارچ ها و تولید الیگوساکاریدها از کیتین نقش دارند. خصوصیات کاتالیتیک آنها، این آنزیم ها را هدف مناسبی جهت استفاده درصنعت یا به عنوان بیوکنترل قرار داده است. در این مطالعه جهت تکثیر و همسانه سازی ژن chit36 از جدایه بومی ایران Trichoderma atroviride PTCC5220، آغازگرهای اختصاصی (chit36pf/chi36r) طراحی و پس از تکثیر قطعه مورد نظر، به منظور تولید پری پلاسمی در وکتور pET26b(+) همسانه سازی و جهت بیان به باکتری E. coli BL21-DE3 انتقال داده شد. در بررسی نتایج حاصل از SDS-PAGE هیچگونه باندی دال بر بیان پروتئین در هیچکدام از شرایط دمایی و میزان متفاوت IPTG در بخش های متفاوت سلولی مشاهده نشد. لذا در ادامه، بیان پروتئین Chit36 با حذف پپتید نشانه pelB (جهت تولید به صورت سیتوپلاسمی) همراه با توالی هیستیدین در انتهای کربوکسیلی دردستور کار قرارگرفت. باکتری حاوی سازه نوترکیب تحت شرایط القایی متفاوت مورد بررسی قرار گرفت. علیرغم عدم مشاهده هیچگونه باندی در هیچکدام از شرایط القایی با روش SDS-PAGE، بیان اندک پروتئین در 2 کلنی با استفاده از روش Western blot مورد تایید قرار گرفت. به منظور بهینه سازی شرایط بیان، میزان بیان پروتئین نوترکیب نسبت به پروتئین تام باکتری درشرایط متفاوت القایی، به روش سنجش کمی باند های پروتئینی روی ژل SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصله نشان داد که بهترین شرایط بیان در زمان القا OD600 : 0.3 و میزان IPTG یک میلی مولار و زمان انکوباسیون 6 ساعت می باشد، دراین شرایط میزان بیان پروتئین نوترکیب نسبت به پروتئین تام برابر %57/ 45 می باشد.