کلونینگ و ارزیابی بیوانفورماتیکی ژن مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز (MDHAR) در گیاه آلوروپوس لیتورالیس و بررسی بیش بیان آن در گیاه توتون (Nicotina tobacum)

شوری خاک یکی از مهم ترین عوامل غیرزنده ، با برهم زدن شرایط مطلوب است که سبب بروز اختلالات متابولیسمی در سلول های گیاهی، از جمله افزایش تولید انواع گونه های اکسیژن فعال (ROS) می گردد .مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز (MDHAR) یکی از آنزیم های کلیدی در مسیر گلوتاتیون-آسکوربات است که نقش احیاکنندگی رادیکال های مونودهیدروآسکوربات را بر عهده دارد. در تحقیق حاضر آنزیم مونودهیدرو آسکوربات ردوکتاز، از گیاه هالوفیت آلوروپوس لیتورالیس (Aeluropus littoralis) شناسایی، جداسازی و هم سانه سازی گردید و به گیاه توتون انتقال داده شد. برای این منظور با توجه به اطلاعات در دسترس در پایگاه NCBI، پرایمرهای مناسب طراحی و با روش RT-PCR توالی ژنی مذکور تکثیر و به منظور توالی یابی در وکتور pTZ57R/T درون باکتری ای.کلای (DH5α) هم سانه سازی شد. سپس به منظور انتقال به گیاه توتون، با آنزیم pfu دی. ان. آ. پلیمراز تکثیر گردید. پس از الحاق پروموتر و ترمیناتور 35S به ناقل بیانی pGreen0029، توالی ژنی MDHAR نیز به این ناقل وارد شد و سازه ی نوترکیب به سلول های اگروباکتریوم نژاد LBA4404 ترانسفورم شد و برای تراریخت سازی توتون به روش دیسک برگی مورد استفاده قرار گرفت. از گیاهان باززایی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین استخراج DNA و سپس RNA صورت گرفت و آزمون های PCR و RT-PCR انجام شد. آزمون PCR با DNA گیاهان انتخابی نشان داد توالی ژنی MDHAR به سلول های گیاهان تراریخت وارد شده و بیان مستمر این ژن نیز توسط آزمون RT-PCR تایید شد. بررسی های بیوانفورماتیکی روی ژن نشان داد که ژن MDHAR شامل 1436 جفت باز و فاقد نواحی اینترونی است. مقایسه ی توالی به دست آمده با توالی های سایر MDHAR های گیاهی ثبت شده در بانک ژن، بیانگر شباهت بالای این ژن با سایر MDHR های جدا شده از گیاهان خانواده ی گندمیان بوده که با MDHAR سورگم (Sorghum bicolor)، بیشترین شباهت را داشت. آنالیز ساختار پروتئینی، بین سلولی بودن و نواحی موتیف pyr-redoxin و SDR را اثبات کرده و نیز بررسی ساختار ثانویه، نشان دهنده ی 3/78 درصد ساختار مارپیچ آلفا، 1/41 درصد ساختار چین خورده ی بتا و 6/13 درصد ساختار دور بتا یا دور معکوس بود.