طراحی RNA دو رشته ای با راندمان بالا برای ایجاد ناقل RNAi امگا گلیادین در گندم

فناوری ریبونوکلئیک اسید مداخله گر (RNAi) به عنوان یک ابزار قدرتمند برای خاموشی بیان ژن هدفگیری شده برپایه تشابه توالی نوکلئوتیدی می باشد. RNA مداخله گر می تواند در کاهش بیان ژنی اپی توپ های امگا گلیادین که باعث ایجاد حساسیت غذایی وابسته به گندم (WDEIA) می شود، مورد استفاده قرار گیرد. حساسیت غذایی یا آنافیلاکسی وابسته به گندم از آنجا منشا می گیرد که آنتی بادی ها، به خصوص IgE در فرد بیمار، نقشی مخالف عمل محافظت کنندگی خود دارند. در گیاهان، RNA دو رشته ای با انتهای آزاد دو یا سه نوکلئوتیدی بخاطر قابلیت شناسایی با آنزیم Dicer یکی از ارکان مهم RNA مداخله گر محسوب می شود. بنابراین توجه به ایجاد انتهای آزاد ʹ3 با نوکلئوتید های گوانین-سیتوزین در RNAi دورشته ای اختصاصی ژن امگا گلیادین با عملکرد بالا هدف گیری شد. در این تحقیق عملکرد بالای ساختار ثانویه RNA دو رشته ای با محتوای نوکلئوتیدی گوانین-سیتوزین 35 تا 50 درصد بررسی شد. قطعات سنس و آنتی سنس طبق نقشه کاست در ناقل pTG19-T همسانه سازی شده و سپس برای تولید و ارزیابی مولکول RNAi مورد نظر به ناقل بیانی pAHC25 منتقل شد. انرژی آزاد موثر برای آنزیم Dicer، تغییرات نوکلئوتیدی برای نواحی RNA دو رشته ای و درصد گوانین-سیتوزین مورد ارزیابی اولیه قرار گرفتند. بطوری-که در ناحیه انتخابی برای ساخت کاست، میزان نوکلئوتید های گوانین- سیتوزین در حدود 7/35 الی 2/45 درصد و انرژی آزاد 7/24- الی 7/28- کیلوکالری برمول ارزیابی شد. پس از همسانه سازی موفق قطعه سنس، شباهت 100 درصدی برای ناحیه تشکیل دهنده ساقه سنجاق سری (hair-pin stem) به طول 185 جفت باز حاصل شد. طبق نقشه کاست توالی باقی مانده از قطعه سنس نیز نقش فاصله انداز و یا تشکیل دهنده لوپ در مولکول RNAiرا ایفا نمود. سرانجام، با انتقال کاست RNAi به ناقل بیانی pAHC25، ناقل خاموشی اختصاصی و با راندمان بالا برای ژن امگا گلیادین نوع D1 حاوی اپی توپ WDEIA تولید شد.