کلون، بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم کربوکسی پپتیداز G2

متوتروکسات یکی از داروهای پرمصرف در شیمی درمانی است که نارسایی کلیوی یکی از عوارض جانبی آن است. آنزیم کربوکسی پپتیدازG2 (گلوکارپیداز تحت نام تجاری وراکساز) آنزیمی باکتریایی است که میتواند متوتروکسات را به متابولیت های غیرفعال خود تبدیل کند و پس از درمان با دز بالای متوتروکسات، منجر به حذف آن از مسیر غیرکلیوی می شود.

در این پروژه ابتدا ژن کربوکسی پپتیداز G2 به دست آمده از سایتNCBI  (Accession number: ACY05517) در داخل وکتور pUC57 توسط شرکتGene Cust  سنتز شد ,سپس برای ادامه روند، وکتور pUC57 که حاوی ژن کربوکسی پپتیداز G2 بود از باکتری استخراج شد و به عنوان الگو در واکنش PCR به همراه پرایمرهای دارای سایت برش NdeI  و  XhoIمورد استفاده قرار گرفت. پس  از آن بر روی محصول PCR  هضم آنزیمی صورت گرفت و در بین سایت های مورد نظر در وکتور بیانی pET28a کلون گردید. در نهایت پلاسمید نوترکیب به داخل سویه بیانی E. coli BL21 ترنسفورم شد و تعدادی از پلاسمیدهای تایید شده از طریق Colony PCR برای تعیین توالی با پرایمر T7 promotor و T7 terminator، ارسال شدند. نتایج تعیین توالی نیز حضور ژن را تایید کردند، پس از آن بیان تحت شرایط بیانی مختلف بهینه گردید.

یافته ها: 

بیشترین سطح بیان در غلظت 5/0 میلی مولار IPTG دمای 25 درجه سانتیگراد و مدت زمان انکوباسیون 6 ساعت تعیین شد. در انتها پروتئین مورد نظر از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز تخلیص و ویژگی های سینتیکی آن بررسی شد.  pH و دمای بهینه فعالیت آنزیم به ترتیب 7 و C25 به دست آمد. برای سوبسترای متوتروکسات μM 24Km=  و  μmol/min  005431/0 Vmax = محاسبه شد.

نتیجه گیری:

 این مطالعه به منظور تولید و فرآوری آنزیم کربوکسی پپتیداز G2 بوده و در آینده این آنزیم می تواند کاندیدای بالقوه ای برای کاهش اثرات جانبی شیمی درمانی باشد.