ویرایش ژنی هدفمند در سلول های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین های CRISPR/Cas9

 ناک اوت ژنی سلول‌های T پرایمری با واسطه‌ی Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) محدودیت‌های زیادی برای کاربردهای بالینی دارد. انتقال مستقیم پروتئین نوترکیب Cas9 و Guide RNA (gRNA) سنتتیک به عنوان یک کمپلکس ریبونوکلیوپروتئینی از پیش مونتاژ شده (Ribonucleoprotein یا RNP) به یک روش قدرتمند برای ویرایش ژنی بسیار کارآمد در سلول‌های T پرایمری تبدیل شده است. در این مطالعه، از سیستم انتقال مبتنی بر Cas9 RNP برای ناک‌اوت هدفمند ژن‌های T Cell receptor alpha constant (TRAC) و β2 microglobulin (B2M) در سلول‌های T پرایمری انسانی استفاده گردید.

روش‌ها: 

بدین منظور gRNAهای اختصاصی برای هدف قرار دادن اگزون‌های ابتدایی ژن‌های TRAC و B2M طراحی شدند. پروتئین Cas9 و gRNAهای سنتتیک مربوطه به طور جداگانه ترکیب شدند و به سلول‌های T پرایمری انسانی جدا شده از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (Peripheral blood mononuclear cell یا PBMC) الکتروپوریت شدند. کارایی ویرایش ژنی با روش تجزیه و تحلیل Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) و فلوسایتومتری اندازه‌گیری شد.

یافته‌ها: 

سه روز پس از الکتروپوریشن سلول‌های T پرایمری با استفاده از کمپلکس‌های RNP هدف‌گیری کننده‌ی TRAC و B2M، آنالیز TIDE کارایی ناک‌اوت 60-13 درصد را برای gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی TRAC و 53-21 درصد را برای gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی B2M مشخص کرد. آنالیز فلوسایتومتری نیز به ترتیب میزان 76 و 27 درصد سرکوب کامل بیان ژن را برای کارآمدترین gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی TRAC (TRAC-gRNA3) و (B2M-gRNA2) B2M تایید کرد.

نتیجه‌گیری:

 نتایج این مطالعه، نشان می‌دهد که سیستم Cas9 RNP می‌تواند به طور کارآمدی به سلول‌های T پرایمری منتقل و منجر به ناک‌اوت هدفمند ژن گردد. شیوه‌نامه‌ی شرح داده شده در این مطالعه، راهکار ساده و بسیار کارآمدی به حداکثر رساندن کارایی ویرایش در سلول‌های T پرایمری فراهم می‌سازد و روند ویرایش ژن برای ایمنوتراپی‌های نسل بعدی را تسهیل می‌کند.