همسانه سازی، بیان و تخلیص بخش خارج غشایی پروتئین Tir از باکتری E.coli O157:H7 و ارزیابی ساختاری آن

باکتری اشرشیاکلی انتروهموراژیک (Enterohemorrhagic E. coli) سویه ی O157:H7 یک پاتوژن مهم انسان و حیوان است که در انسان موجب بروز اسهال خونریزی دهنده و سندروم اورمی همولیتیک می شود. اتصال به سلول های میزبان اولین گام در تثبیت این باکتری است که به واسطه ی سیستم ترشحی نوع  (T3SS) III و از طریق میان کنش بین پروتیین های ترشحی صورت می گیرد. Tir پروتیینی است که پس از بیان در باکتری و از طریق  T3SS به سلول میزبان منتقل و در غشای آن مستقر می شود و نقش مهمی در اتصال باکتری به میزبان دارد. هدف از این تحقیق ساخت سازه ژنی است که دارای فاکتورهای ویرولانس Tir می باشد.

 طراحی پرایمر اختصاصی برای ژن tir با استفاده از نرم افرازOligo  انجام شد و تکثیر ژن به وسیله واکنش    PCRاز روی DNA الگو صورت گرفت. پس از واکنش های هضم آنزیمی و الحاق ژن درون ناقل بیانی pET28a  ، انتقال ناقل به درون میزبان بیانی انجام شد. پس از تایید همسان سازی ژن، بیان نوترکیب پروتیین   Tirبا استفاده از القاگر IPTG  صورت گرفت. برای تایید پروتیین Tir  آنالیز وسترن بلات انجام شد.

همسان سازی ژن tir درون وکتور pET28a به شکل مناسب بین جایگاه های مطلوب انجام شد و پروتیین Tir پس از القا، پروتیین نوترکیب بیان  مناسب و قابل توجهی نشان داد. آنتی بادی مورد استفاده در وسترن بلات نیز توانست به شکل مناسبی Tir را شناسایی کند.

در این مطالعه، سازه پایدار محتوی ژن tir ساخته شد که بیان نوترکیب قابل توجهی از پروتیین Tir را از خود نشان داد. بنابراین این سازه را می توان برای تولید پروتیین Tir جهت مطالعات ایمنی زایی علیه E.coli O157:H7  به کاربرد..