بهینه سازی بیان، تخلیص و ارزیابی طیف سنجی فلوئورسانس آنزیم کراتیناز در حضور نانوذرات طلا

اهداف:

 امروزه استفاده از روش های بر پایه واکنش های آنزیمی با هدف پایش سلامت افراد به خصوص در حوزه نیروهای نظامی و انتظامی رواج گسترده ای یافته است. یکی از روش های آنزیماتیک، استفاده از آنزیم کراتیناز برای سنجش کراتین و کراتینین در مایعات جهت بررسی سلامت کلیه ها، عضلات و غده تیرویید است. هدف این تحقیق بهینه سازی بیان آنزیم کراتیناز و بررسی اثر نانوذرات طلا بر پایداری آنزیم کراتیناز بود.

این پژوهش در بهار و تابستان سال 1400 در موسسه الکتروشیمی واقع در دانشگاه تهران انجام شد. در این مطالعه ابتدا باکتری E.Coli BL21 حاوی وکتور تکثیری pET28a در محیط TB کشت شد، سپس در دماهای 18، 22، 28، 32 و 37 درجه القا گردید. در ادامه پس از سونیکاسیون، تخلیص آنزیم ها با کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. پس از تایید بیان با SDS-PAGE، غلظت آنزیم های بیان شده در دماهای القای متفاوت با روش برادفورد اندازه گیری و مقایسه شد. در ادامه فعالیت آنزیم ها با روش رنگ سنجی بررسی و مقایسه گردید. نهایتا با روش طیف سنجی فلورسانس، اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتیناز مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی میزان بیان آنزیم کراتیناز در دماهای مختلف در محیط کشت TB نشان داد که در دمای 28 درجه، بیشترین مقدار آنزیم با بالاترین میزان فعالیت حاصل شد. از طرفی طیف سنجی فلورسانس آنزیم کراتیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا در طول موج تهییج 295 نانومتر، کاهش شدت فلورسانس در حضور نانوذرات طلا را نشان داد.

القای بیان در 28 درجه سانتی گراد در محیط کشت TB، آنزیمی فعال تر و غلیظ تر ارایه می دهد. همچنین نانوذرات طلا باعث کاهش شدت فلورسانس آنزیم شد که می تواند نشانگر تغییر در ریزمحیط آمینواسید فلورسانت در ساختار آنزیم کراتیناز باشد.