ارزیابی اثر مایع رویی کشت سودوموناس آئروژینوزا بر رفع اثر مهارکنندگی هپارین در آزمون Real-TimePCR

هپارین یک گلیکوزآمینوگلیکان سولفاته است. خون یک منبع متداول برای ردیابی DNA موجود در انواع نمونه ها می باشد که برای جلوگیری از انعقاد آن از ضد انعقادهایی چون هپارین و  EDTAاستفاده می شود. هپارین به علت داشتن اثر مهارکنندگی شدید برروی PCR در نمونه هایی که قرار است مورد ردیابی DNA قرار بگیرند، بکار نمی رود. جهت حذف اثر مهاری هپارین بر آزمون PCR، روش های فیزیکی، شیمیایی و آنزیمی وجود دارد. مطالعه حاضر ابتدا با هدف مقایسه شدت اثر مهارکنندگی دو ضد انعقاد هپارین وEDTA  بر Real-TimePCR(qPCR)، سپس بررسی اثر آنزیم هپاریناز موجود در عصاره محیط کشت باکتری سودوموناس آیروژینوزا بر رفع اثر مهار کنندگی هپارین طی Real-TimePCR صورت گرفت.روش‎کار: در مطالعه حاضر ابتدا دو نمونه خون هپارینه و EDTAدار جهت بررسی شدت اثر مهارکنندگی مورد آزمون Real-TimePCR قرار گرفتند. سپس در ادامه به نمونه خون هپارینه آلوده به باکتری اشیرشیاکلی در دو گروه با شرایط مختلف، عصاره محیط کشت باکتری سودوموناس آیروژینوزا اضافه شد. در گروه اول ابتدا DNA موجود در نمونه خون هپارینه، توسط روش فنول-کلروفرم ایزوآمیل الکل استخراج شد. سپس‎ گرمخانه گذاری این نمونه ها با عصاره محیط کشت باکتری سودوموناس آیروژینوزا در ساعات مختلف صورت گرفت، اما درگروه دوم، نمونه ها قبل از استخراج DNA، در ساعات مختلف گرمخانه گذاری شدند. همچنین غلظت DNA موجود در هر دو گروه توسط دستگاه نانودرآپ انداز ه گیری شد و در نهایت تمام نمونه ها مورد آزمون Real-TimePCR قرارگرفتند. تجزیه و تحلیل نتایج حاصل از نمونه های مورد پژوهش نشان داد که نمونه خون هپارینه با وجود این که غلظت DNA بیشتری را نسبت به نمونه خون EDTAدار شامل می شود، اما به طور کامل مانع تکثیر ژنوم می شود. همچنین تیمار خون هپارینه به همراه عصاره محیط کشت باکتری سودوموناس آیروژینوزا قبل از استخراج DNA به مدت زمان بیشتر از 24 ساعت، موجب رفع اثر مهاری هپارین طی آزمون Real-TimePCR، حتی در چرخه آستانه (CT:Cycle thershold) پایین تر از نمونه EDTAدار می شود.نتیجه گیری نهایی: استفاده از عصاره محیط کشت باکتری سودوموناس آیروژینوزا ممکن است محققین را قادر سازد، بتوانند بدون نیاز به استفاده از آنزیم هپاریناز تجاری گران بها و محدود، از نمونه خون هپارینه در راستای تقویت و تشخیص ژنوم استفاده کنند.