بررسی مقایسه ای شرایط طبیعی و واسرشته در محلول سازی و تخلیص پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس

لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس عامل اصلی تعدیل سیستم ایمنی و تحریک لنفوسیت های T تنظیمی در میزبان می باشد و باعث افزایش جمعیت سلول های (Forkhead box P3) Foxp3+ و کاهش التهاب می شود و می تواند به عنوان کاندیدای دارویی در درمان بیماری های خودایمن معرفی شود.

مقایسه تخلیص پروتیین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در دو شرایط واسرشته و طبیعی به منظور افزایش بازیابی و حفظ فعالیت زیستی آن می باشد.

 روش‎ کار: 

یک توالی به طول 660 جفت باز از لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در پلاسمید pET32-a سنتز و در باکتری اشریشیا کلی BL21(DE3) در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 6 ساعت با ایزوپروپیل بتا-دی-1-تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG) 1 میلی مولار القا و بیان شد. در مطالعه حاضر بافر لیز کننده اوره 8 مولار (pH=8) و بافر حاوی ایمیدازول 01/0 مولار همراه با لیزوزیم 1 میلی گرم/میلی لیتر برای شکستن سلول های باکتریایی و محلول سازی پروتیین مورد استفاده قرار گرفت. بافرهای فوق همراه با سونیکه کردن، به منظور شکستن سلول های باکتری استفاده شد و لام های میکروسکوپی تهیه و با رنگ آمیزی گرم بررسی شدند. پروتیین نوترکیب استخراج شده تحت شرایط واسرشته و طبیعی با استفاده از رزین نیکل-نیتریلوتری استیک اسید آگاروز و رزین نیکل-نیتریلوتری استیک اسید سفاروز تخلیص شد. ارزیابی ایمونوژنیسیته پروتیین نوترکیب با روش دات بلات با سرم خرگوش چالش شده با پروتیین نوترکیب انجام شد.

بیشترین مقدار بیان پروتیین با وزن مولکولی 41 کیلودالتون در ساعت ششم پس از القا در دمای 37 درجه سانتی گراد با IPTG 1 میلی مولار حاصل شد. بافر اوره 8 مولار (pH=8) حاوی لیزوزیم 1 میلی گرم/میلی لیتر همراه با سونیکه کردن، مقدار زیادی از پروتیین نوترکیب استخراج شد. تخلیص پروتیین تحت شرایط واسرشته با استفاده از رزین نیکل- آگاروز مقدار پروتیین بیشتری نسبت به رزین نیکل سفاروز بازیابی شد. نتایج آزمایش دات بلات نیز حضور آنتی بادی IgG (Immunoglobulin G) اختصاصی علیه پروتیین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در سرم خرگوش ایمن شده تا رقت 1:500 را مورد تایید قرار داد.

نتیجه گیری نهایی:

 استفاده از روش واسرشته بر فعالیت زیستی پروتیین تاثیر منفی نداشت و با این روش مقدار بیشتری پروتیین در سیستم باکتریایی بازیابی گردید. پروتیین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس تخلیص شده با این روش می تواند با اهداف مختلف مورد استفاده قرار گیرد.