جداسازی و شناسایی مولکولی گونه های باسیلوس اندوفیت ریشه درختان کچف در استان های مازندران و سمنان

گونه های باسیلوس (Bacillus spp.) اندوفیت به دلیل ویژگی های سودمند زیستی بیشتر از دیگر جنس های باکتریایی در تحقیقات با هدف کنترل زیستی مورد استفاده قرار می گیرند. از آنجایی که حفظ تنوع زیستی و پایداری جنگل هیرکانی از اهمیت ویژه ای در مدیریت این بوم سامانه حیاتی برخوردار است شناسایی و مطالعه باکتری های مفید و حفاظت کننده از گیاهان می تواند در برنامه های محافظت از گونه های گیاهی ارزشمند موجود در آن نقش بسزایی ایفا نماید. این تحقیق با هدف شناسایی جدایه های باسیلوس اندوفیت ریشه درختان کچف (Carpinus orientalis Mill.) و تعیین ویژگی های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی آنها در شرایط آزمایشگاهی انجام گرفت.

برای جداسازی اندوفیت های باکتریایی، نمونه برداری تصادفی از ریشه درختان کچف ارتفاعات بالابند نوار مرزی استان های مازندران و سمنان (کوه های نواحی جنوبی مازندران و نوار باریک شمال سمنان) در بهار 1397 انجام شد. سوسپانسیون ریشه های ضدعفونی و سپس خرد شده در آب مقطر در محیط کشت Tryptic soy agar کشت شد. نقوش پروتیین های کل سلولی با الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید (Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis)، تعیین ویژگی های فنوتیپی جدایه ها و استفاده از نشانگرهای مولکولی IS50 و BOX و REP به منظور گروه بندی جدایه ها و وجود تنوع در آنها مورد بررسی قرار گرفت. یک نماینده از جدایه های هر گروه انتخاب شده و برای شناسایی مولکولی با بکارگیری آغازگرهای عمومی f27 و r1492 قطعه 1500 جفت باز ناحیه S rDNA16 با PCR تکثیر شد. پس از خالص سازی قطعه تکثیر شده برای تعیین ترادف به شرکت Microsynth سوییس ارسال شد. ترادف های بدست آمده با ترادف های موجود در بانک ژن NCBI به روش BLASTn مقایسه شد. توانایی جدایه ها در تولید سیانید هیدروژن، هورمون IAA، پروتیاز و بیوفیلم نیز ارزیابی شد.

سی جدایه باسیلوس از ریشه های درختان مناطق مختلف در محیط کشت باکتریایی جدا و خالص شدند. بر اساس ویژگی های بیوشیمیایی و مولکولی، جدایه های باسیلوس حداقل در چهار گروه متفاوت قرار گرفتند. مقایسه ترادف ناحیه تکثیر شده از S rDNA16 با ترادف های موجود در ژن بانک NCBI و ترسیم درخت فیلوژنتیکی با الگوریتم Maximum-Likelihood نشان دهنده وجود گونه های Bacillus thuringiensis،B. cereus، B. subtilis و B. velezensis در نمونه ها بود. گونه ی B. thuringiensis به عنوان گونه غالب و B. subtilis به عنوان گونه ی پرجمعیت شناسایی گردید. هورمون IAA تولیدی جدایه ها بین 5 تا 85 میلی گرم در لیتر متغیر بود که بیشترین مقدار آن مربوط به جدایه های گروه B. thuringiensis و کمترین مقدار آن مربوط به جدایه های گروه B. velezensis بود. اکثر جدایه ها توانایی تولید آنزیم های لیپاز، ژلاتیناز، لسیتیناز، پروتیاز و آمیلاز را داشتند. جدایه های B. cereus و B. thuringiensis به مقدار قابل توجهی پروتیاز تولید کردند. بیشترین مقدار بیوفیلم توسط جدایه های گروه B. velezensis تولید شد.

توانایی بالقوه و وجود تنوع در ویژگی های سودمند فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی جدایه های باسیلوس اندوفیت ریشه کچف نشان داد که آنها  می توانند به عنوان منابع مناس افزاینده رشد گیاهان و کنترل زیستی مورد توجه قرار گیرند. این ویژگی ها در گونه های B. thuringiensis و B. cereus قابل ملاحظه بود. پژوهش حاضر اولین بررسی در زمینه شناسایی و تعیین ویژگی های بیوشیمیایی و سودمند زیستی جدایه های باسیلوس اندوفیت ریشه کچف در ایران می باشد.