شناسایی بررسی بیان برخی از microRNAهای حفاظت شده دخیل در مسیر بیوسنتز ویتانولیدها در پنیرباد (Withania somnifera)

پنیرباد (Withania somnifera) متعلق به خانواده سیب زمینی، به صورت یک درختچه کوچک همیشه سبز با ریشه های غده ای بزرگ است و در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری وجود دارد. ترکیبات اصلی پنیرباد، ویتانولیدها هستند که شامل ویتافرینA، ویتانولیدD، ویتانولیدA و ویتانون ها می باشند. ویتافرین A و ویتانون ها بیشتر در برگ های پنیرباد وجود دارند، در حالی که ویتانولید  Aعمدتا در ریشه تولید می شود. بیوسنتز این متابولیت ها به ژن های فارنسیل پیروفسفات (FPP)، سیکلوآرتنول سنتاز (CAS)، استرول متیل ترانسفراز (SMT1) و هیدروکسی متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMGR)، مرتبط با مسیرهای متابولیک مربوط بستگی دارد و RNAهای غیرکدکننده مانند miRNA ها در تنظیم  بیان این ژن ها و آنزیم ها نقش دارند. ژن های miRNA ها، RNAهای کوچک با طول 18- 24 نوکلیوتید هستند که هیچ پروتیینی کد نمی کنند و بروز ژن را در گیاهان و حیوانات تنظیم می کنند. این گروه از RNAهای غیر رمز کننده نقش مهمی در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی ایفا می کنند و به عنوان تنظیم کننده های منفی بیان ژن در یوکاریوت ها فعالیت دارند. این تحقیق با هدف شناسایی و بررسی بیان برخی miRNA های حفاظت شده دخیل در بیوسنتز ویتانولیدها در گیاه پنیرباد اجرا گردید.

در این پژوهش، برای انجام آنالیز HPLC از دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا متصل به آشکارساز ELSD، مدل C-650 استفاده شد. به منظور شناسایی miRNA های حفاظت شده در گیاه پنیرباد از داده های  RNA-seqمبتنی بر همولوژی توسط نرم افزار C-mii از BLASTn با معیارهای تا چهار عدم تطابق وE- value < 10  استفاده شد. ساختار ثانویه miRNAهای متمایز به وسیله نرم افزار Mfold تعیین شد. ژن های هدف miRNAهای نامزد با استفاده از psRNATarget بر اساس پارامترهای زیر شامل: E-value < 1.0E-5، تعداد جایگاه های مورد هدف برابر2، محدوده نداشتن بازهای مرکزی بین 10-11 نوکلیوتید، بیشترین عدم تشابه برابر 2 و بدون هیچ گونه فاصله انتخاب گردیدند و برای پی بردن به عملکرد ژن های هدف از ابزارBLASTx  علیه پایگاه داده پروتیینی استفاده شد. در مرحله گلدهی نمونه برداری از دو بافت برگ و ریشه سه ژنوتیپ W1 (7629245)،W3  (7629241) و W4 (7629244) با سه تکرار تکنیکی و سه تکرار بیولوژیکی انجام گردید. از Real-time PCR برای ارزیابی بیان miRNA5021 و ژن هدف آن SMT1 و miRNA5140 استفاده شد و تجزیه داده های حاصل از بیان با استفاده از روش  CTΔΔ -2 انجام شد.  

با توجه به تجزیه های آماری داده های حاصل از HPLC، بین مقدار ویتافرین آ در سه ژنوتیپ (W1، W3 و W 4) از لحاظ آماری اختلاف معنی داری مشاهده نشد. در بین بافت های مورد مطالعه بیشترین میزان مربوط به برگ W3 و کمترین به ریشه W1 اختصاص داده شده است. برای شناسایی miRNAها ساختار دوم توالی ها با سرور mfold پیش بینی شد. حداقل انرژی آزاد پیچش (MFE) از 15- تا 4/130- kcal.mol متفاوت بود و میانگین آن 98/42- kcal.mol محاسبه گردید. نتایج حاصل از روش RT-qPCR نشان داد که میزان بیان نسبی miR5021 در ریشه W1، W3 و W4 نسبت به شاهد (بافت برگ W1)، 16/1، 37/1 و 17/1 به ترتیب افزایش بیان و در برگ W3 و W4 به ترتیب 1/3 و 7/3 برابر کاهش بیان مشاهده شد. الگوی بیان برای ژن SMT1 در سه ژنوتیپ W. somnifera برای ریشه W1،  W3و W4 به ترتیب 7/7، 8/2 و 4 برابر کاهش و در برگ W3 و W4 به ترتیب 48/2 و 82/1 برابر افزایش بیان نسبت به  شاهد مشاهده شد. همچنین بیان نسبی miR5140 در برگ W3، 57/1 و برای W4 بدون تغییر و در ریشه,WI  W3 و  W4نسبت به شاهد به ترتیب هفت، نه و سه برابر کاهش بیان دیده شد که طبق انالیزهای آماری برای miRNA5021 و miRNA5140 در بین  سه ژنوتیپ برای هر یک از این ژن ها اختلاف معنی داری وجود ندارد.

در مجموع با توجه به نقش تنظیمی miRNAهای شناسایی شده در این مطالعه، می توان از این ژن ها در شناسایی بهتر و دقیق تر مسیر بیوسنتز ویتانولیدها استفاده کرد.