کلون کردن، تعیین توالی و مطالعه خصوصیات ژن و cDNA بتا 1 و 4 اندوگلوکوناز I قارچ Trichoderma reesei

اندوگلوکاناز از آنزیمهای سلولازی می باشد که پیوندهای بتاگلوکوزیدی را بطور اتفاقی در ملکولهای سلولز قطع نموده وتولید قطعات کوتاه الیگوساکاریدی می کند. در این تحقیق، تعداد 6 جدایه قارچ تریکودرما از نظر تولید آنزیمهای سلولازی در محیط مندلز مورد بررسی قرار گرفته و جدایه Trichoderma reesei PTCC5142 با تولید U/ml 37/0 بعنوان فعالترین جدایه از نظر تولید آنزیم بتا 1 و 4 اندوگلوکاناز انتخاب گردید. همچنین جهت شناسایی ژن کد کننده آنزیم بتا 1 و 4 اندوگلوکانازI (eglI) از جدایه انتخابی، استخراج DNA ژنومی بروش CTAB صورت گرفت. برای تکثیر این ژن از دو پرایمر اختصاصی (EB1, EF1) استفاده گردید و قطعه مورد انتظار بطول bp 1524 بدست آمد. الگوی هضم آنزیمی (restriction pattern) توسط دو آنزیم EcoRV و PstI قطعه مذکور را تایید کرد و پس از کلون در وکتور pBluscript SK (+) جهت تعیین توالی مورد استفاده قرار گرفت. همچنین توسط RT-PCR، cDNA ژن مذکور تهیه (bp 1380) و بعد از تایید و کلون کردن در وکتور pBluscript SK(+) تعیین توالی گردید. مقایسه توالی DNA ژنومی و cDNA مربوطه نشان داد که توالی کد کننده این ژن پروتئینی بطول 459 اسید آمینه را کد می نماید. توالی DNA بدست آمده از این ژن با توالی ثبت شده ژن بتا 1و4 اندوگلوکانازI در gene bank مربوط به قارچ T. reesei VTT-D-80133، سه نوکلئوتید اختلاف داشت در صورتیکه در سطح پروتئین اختلاف به دو اسید آمینه در ناحیه کاتالیتیکی این آنزیم محدود می گردد. مقایسه ساختمان سوم ناحیه کاتالیتیکی این آنزیم با آنزیم eglI قارچ T. reesei VTT-D-80133 نشان می دهد که موقعیت نسبی اتمهای(backbone (1480 بین دو ساختار مذکور با RMSD برابر با? 47/. و بر اساس 370 کربن a معادل در دو ساختار با RMSD برابر? 4/0 تطبیق می کند.