کلون کردن، بیان و شناسایی پروتئین P35 توکسوپلاسما گوندی در اشریشیاکلی

ساختن پلاسمید نو ترکیب pGEX-P35، بیان ژن کد کننده آنتی ژن سطحی P35 تک یاخته و ارزیابی اولیه توانایی پروتئین حاصل از بیان ژن در ردیابی آنتی بادی های اختصاصی توکسوپلاسما گوندی.
قطعه ای DNA حاوی 450 نوکلئوتید از ژن P35 به وسیله PCR تکثیر و در وکتور pGEM-T کلون و تعیین سکانس شد. سپس ژن مذکور با آنزیم های Sall و BamHl که در قسمت ''5 پرایمرهای آن تعبیه شده بود از وکتور pGEM-T جدا و در وکتور pGEX-4T-1 ساب کلون شد. برای تایید اینکه وکتور نو ترکیب قادر است P35 را در باکتری بیان کند، این وکتور به سویه BL21 اشریشیا کلی ترانسفرم و عمل بیان ژن انجام شد. پروتئین نو ترکیب تولید شده خالص و با روش های SDS-PAGE و Westernblotting بررسی شد.
محصول PCR به صورت نوار DNA حاوی 450 نوکلئوتید بر روی ژل آگاروز 1 درصد مشاهده شد. پس از کلون شدن محصول PCR در pGEM-T، نتایج حاصل از تعیین سکانس با داده های موجود در GenBank مقایسه شد که تفاوتی وجود نداشت. پس از قرار گرفتن قطعه ژن در وکتور بیان، نتیجه آنالیز آنزیمی نشان داد که قطعه ژن مذکور با جهت صحیح در وکتور قرار گرفته است. پس از بیان ژن و خالص سازی پروتئین، انجام گرفتن SDS- PAGE نوار پروتئینی 42kDa حاصل از بیان را نشان داد. آنالیز به وسیله وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی موشی بر علیه سویه RH توکسوپلاسما گوندی نشان داد که پروتئین نو ترکیب تولید شده به وسیله آنتی بادی شناسایی می شود.
در این مطالعه قسمتی از ژن کد کننده آنتی ژن سطحی اختصاصی تاکی زوییت توکسوپلاسما گوندی کلون، بیان و تعیین سکانس شد. سکانس مذکور تایید می کند اختلاف سکانس میان ژن های توکسوپلاسما، هر چند از نقاط مختلف جغرافیایی باشند ناچیز است. این سکانس با شماره شناسایی DQ092625 در بانک ژن به ثبت رسید.