کلونینگ، بیان و تخلیص پروتئین SNAP-25

سم های عصبی کلستریدیوم آزادسازی نوروترانسمیترها را به وسیله ی پروتئولیز اختصاصی و انتخابی SNAP-25، سیناپتوبروین VAMP و سینتاکسین، مهار می کنند. پروتئین SNAP-25 یکی از پروتئین های تشکیل دهنده ی مجموعه ی لنگراندازی (Docking complex) در پایانه های عصبی است. این پروتئین سوبسترای سم عصبی بوتولینوم، سروتیپ های A، C و E می باشد. هر کدام از این سروتیپ ها به طور اختصاصی و در جایگاه ویژه SNAP-25 را در یک پیوند آمیدی برش داده و از تشکیل مجموعه ی لنگراندازی و در نهایت اگزوسیتوز نورترانسمیترها و انتقال پیام عصبی جلوگیری می کنند. در آزمایشگاه می توان با تولید SNAP-25 به روش نوترکیب از آن به عنوان سوبسترای سم، در تشخیص تیپ های E وA سم بوتولیسم بهره برد.
در این مطالعه بر آن شدیم که این پروتئین را به صورت نوترکیب تولید کنیم. برای این منظور cDNA ژن مورد نظر با استفاده از روش از RNA تام استخراج شده از سلول های مغز موش صحرایی تهیه و توسط RT-PCR تکثیر شد. محصول PCR روی ناقل pET32a همسانه سازی شد و پروتئین نوترکیب بیان شده به کمک روش وسترن بلاتینگ و با استفاده از آنتی بادی اختصاصی مورد تایید قرار گرفت و در نهایت با استفاده از یک ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی (Ni-NTA) تخلیص و با کمک آنزیم اینتروکیناز فیوژن از پروتئین مورد نظر جدا شد.
در این تحقیق شرایط بهینه برای بیان پروتئین نوترکیب SNAP-25، استفاده از غلظت یک میلی مولار IPTG، مدت زمان انکوباسیون 5 ساعت در دمای 37 درجه ی سانتی گراد تعیین شد. در تخلیص پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون Ni-NTA، غلظت 250 میلی مولار ایمیدازول باعث جداسازی و تخلیص پروتئین نوترکیب شد. هم چنین استفاده از آنزیم اینتروکیناز برای برش فیوژن در دمای 37 درجه ی سانتی گراد نسبت به دمای محیط نتایج بهتری را به همراه داشت.
پروتئین نوترکیب تخلیص شده ساختار خود را در حین تخلیص از دست نداده و جهت برش و انجام آزمایشات بعدی مناسب و قابل استفاده می باشد. از آن جا که سایر روش های تشخیصی سم بوتولیسم از جمله روش استاندارد تزریق به موش بسیار وقت گیر می باشند لذا استفاده از این محصول نوترکیب به عنوان سوبسترا جهت تشخیص سم در آزمایشگاه می تواند تا اندازه ای مشکلات موجود در روش های قبلی را مرتفع سازد.