طراحی روش واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی نسبی برای بررسی بیان ژن CD40 در سلولهای دندریتیک پس از مهار با آنتی سنس

سلول های دندریتیک در تنظیم وکنترل پاسخ های ایمنی نقش مهمی به عهده دارند. امروزه نظر بر این است که از این سلول ها در درمان بسیاری از بیماری ها می توان استفاده کرد. یکی از راه های ایمونوتراپی ایجاد سلول های دندریتیک تولروژن از طریق ممانعت از بیان مولکول های کمک تحریکی است.CD40 یکی از مولکول های کمک تحریکی بوده که با ممانعت از بیان آن از طریق روش هایی مانند آنتی سنس و یا SiRNA می توان به این مهم (سلول های دندریتیک تولروژن) دست پیدا کرد. با تولید سلول های دندریتیکی تولروژن می توان افقی روشن در درمان بسیاری از بیماری ها ایجاد نمود و با طراحی RT-PCR کمی برای اندازه گیری میزان بیان می توان راه را برای ایجاد این سلول ها هموار نمود. در این تحقیق با طراحی آنتی سنس با استفاده از نرم افزارهای مربوط و منتقل کردن آن به سلول های دندریتیکی با استفاده از ماده”لیپوفکتامین 2000“(Invitrogen) به سلول دندریتیک تولروژن رسیده ایم. در این مطالعه سلول های دندریتیک از طحال موش Balb/c جدا شد و میزان خلوص به وسیله فلوسیتومتری بر اساس نشانگر CD11Cتعیین شد. رده سلولیBCL1 به عنوان گروه کنترل، بیان کننده CD40 در محیط کشت FCS 10% RPMI-1640+ کشت داده شدند. با استفاده نرم افزارهای بیوانفورماتیک Beacon Designer و mfold and Blast آغازگر برای) GADPHبه عنوان کنترل داخلی) و CD 40 طراحی شد، کیت RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) برای استخراج RNA مورد استفاده قرار گرفت و با تعیین O.D280/260 و الکترفورز در آگارز میزان خلوص تعیین شد. در ادامه کار ابتدا PCR کیفی با استفاده از آنزیم Fast Hot Start Taq (Roche) بهینه شد و سپس بعد از ساخت cDNA با استفاده از کیت IQ sybergreen (Biorad)،RT-PCR کمی برای CD40 بهینه و در نهایت با استفاده از همین کیت منحنی استاندارد پس از تهیه رقت های مناسب از RNA برای CD40 و کنترل داخلی محاسبه شد. پس از طراحی آنتی سنس با استفاده از نرم افزار های بیوانفورماتیک با استفاده از ماده”لیپوفکتامین 2000“انتقال، انجام و با استفاده از RT-PCR کمی میزان کاهش بیان ژن مشخص شد. دمای بهینه اتصال با استفاده ازشیب Real time PCR و بهترین CT و Rn∆ در 5/95 درجه سانتی گراد برای هر دو ژن CD40 و GADPH تعیین و همچنین دمای ذوب PCR حدود 84 درجه سانتی گراد مشخص شد. شیب و بازدهی واکنش PCR برای ژن های CD40 و GADPH با روش رقت سریال تعیین شد. با استفاده از غلظت نابرابر آغازگرها بازدهی و شیب برابری این دو ژن با دمای اتصال یکسان تعیین شد. (بازده CD40: 5/96، شیب: 408/3-؛ بازده GADPH: 1/94، شیب: 471/3-) میزان کاهش بیان ژن پس از انتقال با آنتی سنس 64/1در سلول های دندریتیکی و در رده سلولی BCL132/1 تعیین شد. ماده منتقل شده تاثیری روی بیان ژن ندارد. بهترین زمان برای اندازه گیری کاهش بیان ژن CD40 48 ساعت پس از انتقال در سلول های دندریتیکی و رده سلولی BCL1 است. در مطالعات مختلف از روش های متفاوتی مانند RT-PCR نیمه کمی RT-PCR کمی مطلق و RT-PCR کمی نسبی برای تعیین میزان بیان ژن های مختلف ازجمله CD40 استفاده شده است. بررسی ها در این تحقیق نشان داد که استفاده از کیت IQ–sybergreen (Biorad) و الیگومر دی اکسی تیمیدین برای سنتز cDNA برای رسم منحنی استاندارد ژن CD40 بسیار مناسب است (در این مورد GADPH کنترل داخلی مناسبی است) که در مقایسه با RT-PCR نیمه کمی دقیق تر و قابل اعتمادتر است.