تولید سلول های ناپذیرا برای مطالعه HIV-1 vif

مولکول APOBEC3G، به عنوان فاکتور سلولی دخیل در میانکنش با vif HIV-1 عمل می کند که برای بررسی میانکنش آن با vif HIV-1، از سلول های ناپذیرای طبیعی و ذاتی مثل H9 و PBMCانسانی مولد APOBEC3G استفاده می شود. به دلیل ناکارآمدی آنها در این نوع بررسی ها، نیازمند سلول های ناپذیرایی بودیم که به طور ثابت و به میزان بالا تولید APOBEC3G بنماید. لذا از سلول های293T برای ایجاد این دسته از سلول ها استفاده شد.
از سلول های 293T برای تولید سلول های ناپذیرا (non-permissive) استفاده شد که این کار پس از ترانسفکشن با کلون های مولکولی PcDNA-APO3G صورت گرفت و سپس با روش وسترن بلاتینگ، میزان بیان آنها بررسی شد. همچنین فعالیت رپلیکاسیون HIV-1 با استفاده از RT assay و عفونت زایی آنها به وسیله MAGI assay بررسی شد.
در این مطالعه، تعدادی رده سلولی 293T ابرازکننده یک فاکتور انسانی ضد HIV-1 به نام APOBEC3G تهیه شد. به آسانی از طریق ایمونوبلاتینگ اثبات شد که چهار کلون از هفت کلون مورد بررسی، APOBEC3G را ابراز می کنند. به ویژه مشخص شد که دو کلون (A3G-C1،A3G-C4) تولید مقادیر بالاتری از APOBEC3Gرا در مقایسه با کلون های سلولی Pooled می نماید. اثربخشی ترانسفکشن همه این کلون ها مشابه سلول های والد بود؛ با تولید سطح قابل قیاسی از ویریون ها در نتیجه ترانسفکشن کلون های DNAویروسی نوع وحشی و vif منفی (- vif). به علاوه سطح ابرازی APOBEC3G در بهترین رده سلولی (A3G-C1)، بسیار بالاتر از سطح ابرازی در یک رده سلولی لنفوسیتی APOBEC3G مثبت و سلول های تک هسته ای خون محیطی بود. در نهایت دخول APOBEC3G در ویریون های تولید شده در A3G-C1 مونیتور و پیگیری شد. APOBEC3Gبه راحتی در ذرات ویروسی پروژنی در نتیجه ترانسفکشن کلون پروویروسی vif منفی، و نه در کلون نوع وحشی، تشخیص داده شد.
این نتایج مشخص ساختند که رده سلولی جدید تولید شده برای مطالعات مختلف بررسی میانکنش APOBEC3G انسانی و HIV-1 vif مفید است.