کلون کردن ژن کیتیناز 42 (chit42) از جدایه Trichoderma atroviride و مطالعه ساختار آن

قارچ تریکودرما، به دلیل ترشح انواعی از آنزیمهای کیتینازی، بعنوان عاملی قوی در کنترل بیولوژیک بیماری های قارچی مورد استفاده قرار می گیرد. این آنزیمها، غالبا با فرو پاشیدن اجزای ساختاری قارچها، به مبارزه با این عوامل بیماریزا می پردازند. در میان اجزای ساختاری قارچ، دیواره قارچی، نخستین و مهم ترین سدی است که در برابر اثر آنزیمهای هیدرولازی قرار می گیرد. از این رو، بسیاری از آنزیمهای هیدرولازی بویژه آنزیمهای کیتینازی، وظیفه اختصاصی از بین بردن اجزای تشکیل دهنده دیواره قارچی را بر عهده می گیرند. از آنجا که جدایه Trichoderma atroviride در میان 30 جدایه مختلف قارچ تریکودرما جمع آوری شده در این آزمایشگاه در سنجش فعالیت آنزیمهای کیتینازی دارای بیشترین میزان فعالیت آنزیمی می باشد، بنابراین در این تحقیق با توجه به اهمیت آنزیم کیتیناز (42 کیلو دالتونی (Chit42 در فرآیند کنترل بیماری قارچی نسبت به کلون کردن ژن chit42 این جدایه و مطالعه آن اقدام گردید. جهت شناسایی ن کیتیناز 42 (chit42)، استخراج DNA نومی از جدایه قارچ T. atroviride به روش CTAB صورت گرفت. برای تکثیر این ن از دو آغازگر اختصاصی (CUM1/CDM2) استفاده گردید و قطعه مورد انتظار به طول تقریبی 1.6 kb تکثیر گردید. آنزیم XhoI جهت بررسی الگوی هضم آنزیمی قطعه تکثیر شده مورد استفاده قرار گرفت و صحت قطعه تکثیر شده را مورد تایید قرار داد. قطعه تکثیر شده در ناقل pUC19 کلون شده و جهت تعیین توالی ژن مذکور مورد استفاده قرار گرفت. مقایسه توالی به دست آمده با توالی های ثبت شده در بانک ن، ژن کلون شده chit42 را مورد تایید قرار داده و پلاسمید حاصله بنام pMJH1 نامگذاری گردید. بررسی توالی به دست آمده نشان داد که طول این ژن برابر bp 1573 بوده و دارای سه ناحیه اینترونی به طول bp 58، bp 62 و bp 70 می باشد. مقایسه توالی نوکلئوتیدی کامل این ژن با توالی ژن chit42 از سایر قارچها نشان داد که طول اینترون های آنها حدودا برابر می باشد. ضمنا تعداد اسید آمینه های این آنزیم برابر421 اسید آمینه می باشد. مقایسه توالی اسید آمینه آنزیم Chit42 به دست آمده در این تحقیق با توالی گزارش شده مربوط به آنزیم Chit42 از قارچهای T. aureoviride، T. viride، T. harzianum، T. longibrachiatum و T. koningii نشان داد که میزان مشابهت آنها به ترتیب برابر 100، 98، 98، 97 و 96 درصد می باشد.