اندازه گیری میزان آفلاتوکسین متصل به آلبومین در نمونه سرم با استفاده از روش بهینه شده کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و آشکارگر فلورسانس

با توجه به آثار مرگ بار آفلاتوکسین ها و به خصوص آفلاتوکسین B1 بر سلامتی انسان، اندازه گیری آفلاتوکسین متصل به آلبومین، به عنوان یک شاخص مهم میزان در معرض بودن به آفلاتوکسین ضروری به نظر می رسد. هدف از این پژوهش، بهینه سازی روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و آشکارگر فلورسانس به منظور اندازه گیری این شاخص در خون است.
در این مطالعه، از نمونه سرم خون سه گروه رت به عنوان کنترل مثبت (تیمار شده با آفلاتوکسین B1)، کنترل (بدون تیمار خاص) و استاندارد (تیمار شده با میزان معینی آفلاتوکسین B1 نشان دار با تریتیوم) استفاده شد. پس از جداسازی آلبومین از نمونه سرم با استفاده از آمونیوم سولفات و اسید استیک، خلوص آلبومین با الکتروفورز SDS-PAGE بررسی و غلظت آن به روش برادفورد اندازه گیری شد. سپس آلبومین تحت تاثیر پروناز هیدرولیز شد تا آفلاتوکسین متصل به آلبومین به صورت آفلاتوکسین- لیزین آزاد شود. سپس آنزیم پروناز و باقیمانده حاصل از هیدرولیز آلبومین توسط استون در سرما رسوب داده و جدا شد. حجم محلول رویی را با دستگاه فریز- درایر تقلیل داده و سپس نمونه تغلیظ شده به دستگاه HPLC تزریق و مقدار آفلاتوکسین موجود در آن در مقایسه با نمونه مشابه حاصل از رت های گروه استاندارد، اندازه گیری شد.
با الکتروفورز SDS-PAGE، خلوص آلبومین جدا شده اثبات شد و غلظت آن در نمونه های کنترل مثبت، منفی و استاندارد به ترتیب 10، 5/12 و 13 میلی گرم در میلی لیتر به دست آمد. در روش HPLC حداقل میزان تشخیص (Detection limit) برای اندازه گیری آفلاتوکسین متصل به آلبومین، 20 پیکوگرم در هر میلی گرم آلبومین، اختصاصیت روش، 92 درصد و حساسیت آن، 100 درصد تعیین شد. میانگین میزان آفلاتوکسین متصل به آلبومین در سرم رت های کنترل مثبت، 10 نانوگرم در هر میلی گرم آلبومین محاسبه شد و تکرارپذیری روش طی بارها تکرار، بسیار خوب ارزیابی شد.
در این تحقیق برای اندازه گیری آفلاتوکسین متصل به آلبومین به روش HPLC تغییراتی در فاز متحرک، درصد حلال ها و زمان هر آزمایش ایجاد شد و همچنین کروماتوگرافی میل ترکیبی قبل از انجام HPLC حذف شد. بر این اساس HPLC-Fluorescence به عنوان یک روش دقیق، حساس و اختصاصی و با بهینه سازی ایجاد شده با سرعت و سهولت بیشتر، تکرارپذیری بالاتر و هزینه کمتر می تواند برای اندازه گیری آفلاتوکسین B1 در سرم استفاده شود.