راه اندازی یک روش جدید سریع و حساس Nested PCR یک مرحله ای-یک لوله ای در سیستم بسته با استفاده از دو آغازگر متصل به هم برای تشخیص ویروس HCV

واکنش زنجیر پلیمراز یکی از مهم ترین پیشرفت ها در زمینه زیست شناسی و تشخیص مولکولی است. با وجود سادگی در مفهوم این روش نیازمند کنش های پیچیده بین توالی هدف، آغازگرها، dNTP و آنزیم پلیمراز به منظور تکثیر و تشخیص موفق است. شناسایی ویروس های RNA دار نیازمند استفاده از روش هایی با حساسیت و ویژگی بالا است، بنابراین تکثیر براساس روش Nested PCR تا حدی منجر به بهبود حساسیت شده و از سوی دیگر، یک مرحله ای کردن روش مذکور باعث کاهش آلودگی های احتمالی خواهد شد. هدف از مطالعه حاضر راه اندازی و به کارگیری روش جدید، سریع و حساس Nested PCR یک مرحله ای- یک لوله ای در سیستم بسته با استفاده از دو آغازگر به هم چسبیده است.
در این مطالعه، روش جدید و ویژه ای از طراحی آغازگر به منظور یک مرحله ای- یک لوله ای کردن واکنش استفاده شد. روش طراحی شده پس از راه اندازی و بهینه سازی، روی نمونه های کنترل مثبت و منفی ارزیابی شد.
روش راه اندازی شده، روی50 نمونه مثبت ویروس هپاتیت C، 10 کنترل منفی ژنوم انسانی و 5 نمونه از هرکدام از ویروس های هپاتیت B، نقص ایمنی اکتسابی انسان، هپاتیت G و تورکوتنو انجام گردید. براساس نتایج به دست آمده از مجموع آزمایشات میزان حساسیت و ویژگی روش طراحی شده، محاسبه شد. در 48 مورد از 50 نمونه مثبت باند مورد انتظار مشاهده گردید و در هیچ یک از نمونه های کنترل منفی باندی مشاهده نشد.
براساس سیستم ویژه طراحی آغازگر که در مطالعه حاضر استفاده شد، آغازگرهای داخلی به صورت مکمل حالت معمول PCR و چسبیده به آغازگرهای خارجی ساخته می شوند. احتمال اتصال آغازگرهای خارجی و داخلی به الگوهای نادرست در هر دو دور واکنش غیرممکن می شود و در نتیجه باندهای غیراختصاصی تولید نخواهد شد. برتری دیگر روش طراحی شده عدم وجود آلودگی به دلیل یک مرحله ای شدن و علاوه بر آن؛ کوتاه تر شدن زمان واکنش و نیز کاهش هزینه ها است.