تشخیص سریع اسپور عامل سیاه زخم به روش مولکولی

باسیلوس آنتراسیس باکتری اسپور دار، گرم مثبت، هوازی و عامل بیماری سیاه زخم است. در سال های اخیر از این باکتری در حملات بیوتروریستی استفاده شده است. اسپور باسیلوس آنتراسیس نسبت به عوامل فیزیکی و شیمیایی بسیار مقاوم می باشد. برای تشخیص سریع اسپور این باکتری به روش های مولکولی، به اسنخراج ژنوم با شکستن اسپور نیاز می باشد. هدف از این مطالعه تشخیص سریع مولکولی D NA باسیلوس آنتراسیس به روشMultiplex PCR با شکستن سریع اسپور به روش فیزیکی در زمان بسیار کوتاه و بدون استخراج ژنوم است.
اسپورباکتری غیر بیماریزای سیاه زخم یا سویه استرن (سویه واکسن باسیلوس آنتراسیس) توسط سیستم (BioSpec Products، In.) Mini Bead Beater-8 با استفاده از بید های 0.1 میلی متری در 5000 دور در دقیقه شکسته و استخراج شد. تشخیص به روش PCR Multiplex با استفاده از 3 جفت پرایمر صورت گرفت. PCR سه قطعه DNA با اندازه های مورد انتظار را تولید نمود که در ژل آگاروز الکتروفورز آنالیز شد. جهت تعیین حد تشخیص و اختصاصیت از رقت های مختلف اسپور به روش CFU/ml و باکتری های دیگر همین جنس نیز استفاده گردید.
اسپورهای باسیلوس آنتراسیس در عرض سه دقیقه شکست شد. با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و Multiplex PCR، محصولات به دست آمده شامل سه قطعه (1083bp، 385bp، 164bp) در ژل آگارز 2 درصد آنالیز شد. با استفاده از آنزیم برش دهنده Hind IIIمحصول (1083bp) تایید گردید. حد تشخیص بر اساس روش CFU/ml، رقت 1.512 از سوسپانسیون با 7680/ml یا 7 اسپور در میلی لیتر اسپور معین شد.
نتایج بهینه سازی نشان داد شکستن به روش فیزیکی با استفاده از ذرات شیشه و دستگاه Bead Mill Homogenization از سرعت لازم برخوردار می باشد. بعد از شکست در مدت 3 دقیقه، نیازی به استخراجDNA نیست. با این روش، ما توانستیم به طور سریع، اختصاصی و با حساسیت بالا اسپور باکتری باسیلوس آنتراسیس را در نمونه ها تشخیص دهیم.