تولید کلون و بررسی بیان توالی همپوشانی از ژن NS3 ویروس هپاتیت C به وسیله سازه بیانی DNA

هدف تولید یک سازه بیان کننده توالی یک ناحیه همپوشان از ژن NS3 از ویروس ایزوله ایرانی است.

ابتدا بخش میانی ژن NS3 با روش Nested-RT-PCR و با استفاده از سرم بیمار مبتلا به ژنوتیپ 1a ویروس هپاتیت C تکثیر شد. بعد از کلون آن درون ناقل کلونینگ TA و غربالگری کلون ها براساس روش سفید- آبی و Colony-PCR این کلون های منتخب با روش تعیین توالی و هضم آنزیمی با BglII ارزیابی شد. توالی جدید با استفاده از نرم افزار با توالی های دیگر مرجع مقایسه و درخت تکاملی ترسیم شد. بخش میانی ژن NS3 تایید شده و سپس به درون سازه بیانی، کلون شد و کلون های مناسب با استفاده از دو نوع Colony-PCR شناسایی شد. ارزیابی نهایی بیان ژن با مشاهده GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش RT-PCR و وسترن بلات روی سلول های ترانسفکت شده با سازه بیانی تایید شد.

توالی میانی NS3 از روی سرم بیمار تکثیر و نتایج توالی یابی و مقایسه ژنی نشان داد که این توالی به توالی های مرجع شباهت داشته و در شاخه ژنوتیپ 1 ویروس هپاتیت C قرار دارد. با روش Colony-PCR وجود و نیز جهت ژن درون پلاسمید بیانی تایید شد. مشاهده GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش RT-PCR و وسترن بلات به ترتیب نمایانگر انتقال موفق سازه، بیان ژن و نیز تولید پروتئین در سلول های 293 بود.

سازه بیانی حاوی بخش میانی ژن NS3 که بایستی فاقد فعالیت پروتئازی باشد، نسبت به طول کامل ژن NS3 می تواند در القای بهتر ایمنی توسط سلول های عرضه کننده آنتی ژنی در موارد واکسن ویروس هپاتیت C مفیدتر واقع شود.