بهینه سازی روش کشت بافت و سیستم انتقال ژن در گیاه کاهو (Lactuca sativa L.)

گیاه کاهو (Lactuca sativa L.) از جمله سبزی های برگی متعلق به خانواده چتریان (Asteraceae) می باشد. دستکاری ساختار ژنتیکی کاهو نیازمند یک روش پایا و موثر کشت بافت و انتقال ژن می باشد. با توجه به اینکه گیاه کاهو یک بیوراکتور بسیار مناسب به منظور تولید پروتئین های نوترکیب به ویژه واکسن های خوراکی است لذا در قالب این پروژه تحقیقاتی سعی شده است علاوه بر بهینه سازی سیستم کشت بافت این گیاه، مکانیسم مناسب انتقال ژن به آن تعیین گردد. ابتدا اثرات سن ریزنمونه کاهو (کوتیلدون های 3 و 7 روزه ژنوتیپ محلی اهواز) و 7 ترکیب مختلف از هورمون های رشد گیاهی بر روی القا کالوس و شاخه زایی مستقیم آزمایش شد. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی اجرا شد. حساسیت کوتیلدون های کاهو به آنتی بیوتیک هیگرومایسین با کشت کوتیلدون ها روی محیط انتخابی دارای غلظت های مختلف هیگرومایسین ارزیابی شد. برای انتقال ژن از آگروباکتریوم سویه LBA4404 حاوی پلاسمید pCAMBIA1304 استفاده شد و روش PCR برای بررسی گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار گرفت. بالاترین میزان القا کالوس با استفاده از محیط کشت M1 حاوی 54/0 میکرومولار NAA و 44/0 میکرومولارBA برای نمونه های کوتیلدونی 7 روزه بدست آمد. همچنین تعداد بالای شاخه زایی مستقیم در محیط های کشت M1 (حاوی 54/0 میکرومولار NAA و 44/0 میکرومولار BA) و M7 (حاوی 1/0 میکرومولار NAA و 44/0 میکرومولار BA) حاصل شد. مقدار 15 میلی گرم در لیتر هیگرومایسین بطور کامل از باززایی نمونه های غیر تراریخت جلوگیری کرد و بنابراین غلظت 15 میلی گرم در لیتر از آنتی بیوتیک در محیط کشت انتخابگر استفاده شد. شرایط بهینه ای برای تراریختگی، از هم کشتی ریزنمونه های کوتیلدونی با آگروباکتریوم در محیط MS بدون هیچ تنظیم کننده رشدی بدست آمد. آنالیزهای اولیه گیاهان باززایی شده در محیط انتخاب گر، در سطح DNA و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن hph صورت پذیرفت و گیاهان تراریخته انتخاب شدند.