تولید لنتی ویروسهای نوترکیب ناقل ژن فاکتور نوروتروفیک GDNF با تیتر بالا و انتقال آنها به آستروسیتهای انسانی

لنتی ویروسها از جمله موثرترین ویروسهای نوترکیب برای انتقال ژن به سلولها و بافتهای پستانداران بشمار میرود. این مطالعه شامل دو بخش اساسی است: (1) بررسی کارائی ستونهای پروتئینی در تولید لنتی ویروسهای نوترکیب با تیتر بالا و (2) بکارگیری این ستونها درتولید لنتی ویروسهای نوترکیب حامل ژن فاکتورنوروتروفیک GDNF. در بخش اول مطالعه با استفاده از دو ناقل انتقال (حامل GFP یا Jred) تولید لنتی ویروس نوترکیب کردیم. با انتقال سوپرناتان سلولهای ترانسفکت شده به ستونهای پروتئینی Amicon و سانتریفوژ ستونها بیش از 99% سوپرناتان را جدا کردیم تا استوکی در حجم 500 μl از سوپرناتان غلیظ شده و مملو از ویریونها بدست آید. با افزودن رقتهای مختلف این استوک ویروسی به سلولهای هدف، ترانسدوکشن سلولی با موفقیت انجام شد بطوریکه ترانسژنهای گزارشگر در 100% سلولها مشاهده شد. متقابلا تست بخش رقیق سوپرناتان منجر به هیچگونه بیان ژن که نشانگر فعالیت ویروسی باشد نگردید. تولید تیتر بالای ویروسی با روش فیلتراسیون مزبور برای انتقال موفقیت آمیز ژنها اهمیت دارد و از نظر هزینه، حجم کار و زمانبری بر آنها ارجحیت دارد. در بخش دوم این مطالعه، توالی مربوط به فاکتور مهم GDNF را به سازه لنتی ویروسی پیوند زده و به همان روش بالا ویروسهای تیتر بالا تولید کردیم. با انتقال این ویروسها به آستروسیتهای انسانی توانستیم افزایش بیان ژن GDNF را در سطح mRNA بمیزان 3 برابر بدست آوریم. این نتایج نشان دادکه لنتی ویروسهای حامل GDNF را میتوان با روش جاری در تیتر بالا تولید کرده و برای مطالعات تمایزی و حفاظت نورونی مورد استفاده قرار داد.