ساخت حامل های بیانی PEP cDNA موشی و EGFP در سامانه القایی Tet Off

پراکسی زوم ها یکی از اندامک های سلول های یوکاریوتی هستند که دارای وظایف گوناگونی می باشند. یکی از پروتئین های ماتریکس پراکسی زوم به نام پروتئین پراکسی زومی (PEP) نامیده می شود که در سال 2002 کلون گردید. PEP واجد 209 اسید آمینه است و به نظر می رسد که در تمایز بافت های جنین موش نقش دارد. از جمله خصوصیات این پروتئین، افزایش بیان طی میوژنز و تمایز مغز جنین موش می باشد. برای تحقیق برروی نحوه ی عملکرد این پروتئین بر مکانیسم نوروژنز نیاز بود که بتوان در مراحل مختلف نوروژنز، این ژن را خاموش یا روشن کرد و نتایج حاصل از تغییر در بیان آن را بررسی نمود. لذا در مطالعه حاضرPEP cDNA را در سیستم بیانی یوکاریوتی سامانه القایی Tet off وارد نمودیم تا بتوان در آینده آن را به رده سلولی بنیادی ترانسفکت نماییم و بیان بیش از حدآن را توسط داکسی سیکلین یا تتراسیکلین با تنظیم سطح آنتی بیوتیک در سلول های بنیادی موشی بررسی نماییم. برای این منظور نیاز بود که cDNA هدف تکثیر شود و سپس به داخل حامل الحاق گردد. بنابراین در طراحی پرایمر وجود دو محل برش آنزیم محدودالاثر در ابتدا و انتهای ژن همساز با حامل و همچنین توالی Kozak جهت بیان بیشتر پروتنین PEPدرنظر گرفته شد و PEP cDNA تکثیر گردید. با تاثیر آنزیم های محدودالاثر در دو انتهای PEP cDNA نهایتا قطعه برش یافته به داخل حامل pTRE2pur از سیستم بیانی Tet off وارد شد. سیستم بیانیTet off یک سیستم بیانی دوگانه می باشد، به این معنی که واجد یک وکتور به نام Tet off است که یک عنصر پروتئینی را تولید کرده که به واسطه ی آنتی بیوتیک تتراسیکلین یا داکسی سیکلین بیان ژن را در وکتور دوم به نام pTRE2pur، روشن و خاموش می کند. در این سیستم ابتدا باید وکتور Tet off را به سلول هدف ترانسفکت کرده و دودمان سلول پایدار ایجاد نمود و سپس وکتور دوم (pTRE2pur) که حامل ژن است را به این دودمان وارد نمود. برای اینکه به طور یقین پایدار بودن سلول به حامل Tet off را به اثبات برسانیم، علاوه بر ساخت، TRE2pur/PEP cDNA EGFP را بداخل حامل TRE2pur وارد نموده و سازه TRE2pur/EGFP را تهیه نمودیم.