کلونینگ ژن GRA5 توکسوپلاسما گوند ای سویه RH در پلاسمید یوکاریوت

پیام:
چکیده:
مقدمه

توکسوپلاسموز یکی از بیماری های زئونوز و دارای انتشار وسیع در جهان بوده که اثرات شدید بالینی و دام پزشکی عدیده ای را ایجاد می کند. این انگل داخل سلولی باعث عوارض عصبی و بیماری های چشمی در افراد دارای ضعف ایمنی و نوزادان متولد از مادران آلوده می شود. بروز موارد زیاد بیماری همراه با عوارض شدید و کشنده توکسوپلاسموز ضرورت یافتن واکسن موثری برای این بیماری را نشان می دهد. یکی از مهم ترین راه های کنترل بیماری واکسیناسیون است که تاکنون واکسنی موثر علیه این انگل پیدا نشده است. با عنایت به زئونوز بودن بیماری در جهان، یکی از مهم ترین راه های آلودگی انسان مصرف گوشت های خام یا نیم پز حاوی انگل است. بر همین اساس، استفاده از واکسن مناسب حیوانی نیز می تواند باعث تحریک ایمنی حیوان شده و از آن در مقابل تولید کیست در بدن محافظت نماید. با توجه به شیوع وسیع این انگل داخل سلولی در انسان و حیوانات و اثرات شدید و کشنده آن، تولید واکسن های جدید بر علیه این بیماری ضرورت می یابد. ایمن سازی با پلاسمید حاوی ژن های کدکننده پروتئین های محافظت کننده، به عنوان روشی نسبتا ابداعی و راهکاری امید بخش از تکنیک های ساخت واکسن به شمار می آید. به همین دلیل پلاسمید کدکننده ژن 5GRA را تهیه تا بتوان از آن برای ساخت واکسن بر علیه این عفونت استفاده نمود.

مواد و روش ها

در این تحقیق، ژن GRA5 با استفاده از روش PCR در پلاسمید انتقالی pTZ57R کلون و پس از آن در باکتری اشرشیاکلی سوش TOP10 ترانسفورم شد. سپس پلاسمید نوترکیب از باکتری میزبان استخراج و ژن هدف با استفاده از آنزیم های Hind3 و EcoRI از پلاسمید pTZ57Rجدا گردید. در مرحله بعد پلاسمید pcDNA3 برای پذیرش قطعه GRA5 و انجام کلونینگ نیز با آنزیم های Hind3 و EcoRI برش داده شد و ژن GRA5 درون پلاسمید pcDNA3 ساب کلون شد. محصول واکنش اتصال در باکتری فوق ترانسفورم و در محیط LB حاوی آمپی سیلین کشت داده شد. پلاسمیدهای نوترکیب pcGRA5 با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، از باکتری تخلیص و در مرحله بعد در سلول یوکاریوتی CHO ترانس فکت گردید و در خاتمه بیان پلاسمید نوترکیب مورد بررسی قرار گرفت.
یافته های پژوهش: به منظور تایید مراحل مختلف کار از روش های PCR و برش آنزیمی استفاده شد. پس از الکتروفورز مشخص شد که قطعه GRA5 در پلاسمید pcDNA3 کلون شده است. قطعه مورد نظر بر روی ژل الکتروفورز در حدود 363 bp بود که هم اندازه ژن GRA5 توکسوپلاسما گوند ای است. به منظور تایید نهایی، قطعه مورد نظر از تعیین توالی استفاده و با قطعه استاندارد ثبت شده در بانک ژن مقایسه گردید. برای تایید بیان ژن مورد نظر در سلول CHO از روش وسترن بلات استفاده شد.

بحث و نتیجه گیری

نتایج نشان داد که کلونینگ و ترانسفورم قطعه GRA5 در پلاسمید pcDNA3 با موفقیت انجام شده و با استفاده از روش وسترن بلات بیان پروتئین 13 کیلو دالتونی تایید گردید.

زبان:
فارسی
صفحه:
1
لینک کوتاه:
magiran.com/p953975 
برخی از خدمات از جمله دانلود متن مقالات تنها به مشترکان مگیران ارایه می‌گردد. شما می‌توانید به یکی از روش‌های زیر مشترک شوید:
اشتراک شخصی
در سایت عضو شوید و هزینه اشتراک یک‌ساله سایت به مبلغ 400,000ريال را پرداخت کنید. همزمان با برقراری دوره اشتراک بسته دانلود 100 مطلب نیز برای شما فعال خواهد شد!
پرداخت با کارتهای اعتباری بین المللی از طریق PayPal امکانپذیر است.
اشتراک سازمانی
به کتابخانه دانشگاه یا محل کار خود پیشنهاد کنید تا اشتراک سازمانی این پایگاه را برای دسترسی همه کاربران به متن مطالب خریداری نمایند!
توجه!
  • دسترسی به متن مقالات این پایگاه در قالب ارایه خدمات کتابخانه دیجیتال و با دریافت حق عضویت صورت می‌گیرد و مگیران بهایی برای هر مقاله تعیین نکرده و وجهی بابت آن دریافت نمی‌کند.
  • حق عضویت دریافتی صرف حمایت از نشریات عضو و نگهداری، تکمیل و توسعه مگیران می‌شود.
  • پرداخت حق اشتراک و دانلود مقالات اجازه بازنشر آن در سایر رسانه‌های چاپی و دیجیتال را به کاربر نمی‌دهد.