Cell Journal (Yakhteh)
Volume:6 Issue: 3, 2004

تولید جنین های موشی کایمری با استفاده از سلولهای بنیادی جنینی دستکاری شده ژنتیکی بیان کننده واریته هیستونی H2A.Z-EGFP و جنین های تتراپلویید دو بلاستومر جنین های دو سلولی موش نژاد NMRI توسط دستگاه الکتروفیوژن با ولتاژها و زمانهای متفاوت در هم ادغام شدند. در بهترین حالت ادغام جنین های تتراپلویید با سلولهای بنیادی جنینی رویان B1، مشتق از موش C57BL/6 که وکتور H2A.Z-EGFP به آن وارد شده بود و بیان کننده ژن مزبور بود، ترکیب (aggregate) شدند. ورود ژن مزبور به سلولهای بنیادی جنینی با الکتروپوراسیون بود. جنین های ترکیب شده در محیط T6 تا مرحله بلاستوسیست رشد یافتند.
مقایسه میزان ادغام بلاستومرها با الکتروفیوژن و تکوین جنینهای تتراپلوئید نشان داد که با ولتاژ 100 ولت از جریان مستقیم و زمان 25 میلیونیم ثانیه، صددرصد جنین های دو سلولی در هم ادغام شدند و هشتاد و دو درصد جنین های تتراپلویید تولیدی تا مرحله بلاستوسیست و هچینگ بلاستوسیست رشد یافتند. ضمنا 75درصد جنین ها با هم ترکیب شدند که 42درصد بلاستوسیست ها دارای سلولهای بنیادی جنینی ترانسژنی بودند.
در مجموع نتایج این مطالعه نشان داد که می توان از جنین های تتراپلویید و سلولهای بنیادی جنینی دستکاری شده ژنتیکی برای تولید بلاستوسیستهای ترانس ژنی استفاده نمود.

بررسی چگونگی تاثیر اگونیست GnRH به صورت غیرپالسی بر روی تخمدان های رت (Rat) نابالغ.
در این بررسی موشهای نابالغ را به گروه های 7، 17 و 27 روزه تقسیم کرده و هر یک از گروه ها را به چهار زیر گروه چهارتایی تقسیم و به ترتیب به هر زیر گروه میزان 6660ng/kg و 666ng/kg و 66/6ng/kg و یا آب مقطر هر 12 ساعت یک بار به مدت 3 روز به صورت زیر جلدی (S.C) تزریق شد. از موشهای نابالغ نرمال نیز به عنوان گروه شاهد دوم استفاده شد. تخمدانها را پس از قطع نخاعی، خارج و بعد از تدارکات بافتی و رنگ آمیزی، مقاطع به صورت سریال 5 میکرونی با فواصل 1 به 10 از ابتدا تا انتهای هر تخمدان مشاهده شد.
در موشهای 7 روزه تزریق دوز بالا باعث کاهش معنی داری در تعداد فولیکولهای وزیکولار اولیه نسبت به گروه شاهد شد (P<0.05) و در دوزهای دیگر در همین سن تغییرات چشم گیری مشاهده نشد. در گروه سنی 27 روزه دوز بالا سبب تغییری در تعداد فولیکولهای اولیه و فولیکولهای وزیکولار اولیه نگردید لیکن باعث کاهش فولیکولهای وزیکولار ثانویه و گراف شد، اما تعداد جسم زرد به طور محسوسی افزایش یافته بود، در صورتی که در دوز متوسط برخلاف دوز بالا باعث افزایش تعداد فولیکولهای وزیکولار ثانویه و گراف گشته ولی تعداد جسم زرد مانند گروه فوق تا حدی افزایش معنی داری داشت(P<0.05). در مقایسه بین موشهای نابالغ 27 روزه و بالغ 60 روزه نشان می دهد که در بالغین تعداد فولیکولهای اولیه و وزیکولار اولیه نسبت به نابالغین کاهش محسوسی پیدا کرده ولی تعداد فولیکولهای وزیکولهای ثانویه و گراف و جسم زرد نسبت به نابالغین افزایش داشته است (P<0.05)، در صورتی که در مقایسه دوز متوسط در همین سن تقریبا با گروه بالغین همگون بود.
در پایان می توان اظهار داشت که دوزهایی از اگونیست GnRH به صورت غیرپالسی در نابالغین، احتمالا می تواند سبب رشد فولیکولها و همگون شدن آنها نسبت به بالغین شود. دوزهای بالا رشد اولیه فولیکولها را تحریک می کند ولی تکامل و رشد فولیکولهای رسیده را سرکوب می نماید و دوزهای پایین تاثیر چندانی در روند رشد فولیکولها نخواهد داشت.

بررسی اثرات امواج الکتزومغناطیس با فرکانس 27.12 مگاهرتز بر اولترااستراکچر بافت استخوانی جنین رت نژاد Sprague Dawley با استفاده از میکروسکوپ الکترونی موشهای صحرایی باردار در زمانهای مختلف دوران حاملگی (گروه تجربی اول از روز صفر تا ششم بارداری، گروه تجربی دوم از روز هفتم تا سیزدهم بارداری و گروه تجربی سوم از روز چهاردهم تا بیستم بارداری) در میدان الکترومغناطیس با فرکانس 27.12 مگاهرتز با شدت 10 وات بر سانتی متر مربع به مدت هفت روز متوالی و روزانه دردونوبت 15 دقیقه ای و جمعا 210 دقیقه قرار گرفتند. سه گروه شم نیز مشابه گروه تجربی در میدان الکترومغناطیس با شدت صفر قرار گرفتند و گروه کنترل اصلا در میدان امواج قرار نگرفت. برای مطالعه فراساختاری بافت استخوانی جنینها، ناحیه میددیافیز تیبیای راست تعداد 21 جنین 21 روزه مورد بررسی قرار گرفتند.
تابش امواج باعث افزایش دمای کولون رتهای گروه های تجربی گردید به طوری که در بدن رتها هایپرترمی ایجاد گردید. مطالعه فراساختاری ناحیه میددیافیز تیبیای این جنینها در گروه های تجربی، تغییرات را به صورت واکوئولیزه شدن و چروکیدگی سیتوپلاسم، دژنرسانس ارگانل های سیتوپلاسمی مانند میتوکندری و شبکه آندوپلاسمی خشن، چروکیده شدن هسته و افزایش هتروکروماتینی آن در استئوبلاستها واز سوی دیگرکاهش ترابکولای استخوانی در فضای بین سلولی نشان داد که میزان این تغییرات در گروه تجربی دو به مراتب شدیدتر بود.
امواج الکترومغناطیس بافرکانس 27.12 مگاهرتز سبب تغییرات ساختاری در تعدادی ازاستئوبلاستها گشته و اثرات وقفه ای بر روند استئوژنز جنینها داشته است.

بررسی نقش گیرنده های A1 آدنوزینی نورونهای هسته پاراژیگانتوسلولاریس بر فعالیت الکتریکی این نورونها در موشهای کنترل و معتاد حیوانات مورد مطالعه به دو گروه کنترل و وابسته به مورفین تفسیم شدند (در هر گروه 36=n).
در گروه وابسته حیوانات سولفات مورفین را از طریق آب آشامیدنی به مدت 21 روز دریافت می کردند. سپسحیوانات هر دوگروه به منظور ثبت فعالیت الکتریکی از نورونهای هسته PGi در دستگاه استریوتاکس قرار گرفته وتوسط میکرومانیپولیتور یک عدد میکروپیپت ثبات شیشه ای در کنار یک نورون هسته PGi قرار می گرفت. فعالیتالکتریکی نورون به دستگاه تقویت کننده خارج سلولی و سپس به اوسیلوسکوپ هدایت می شد. با استفاده از یکدستگاه Window discriminator فعالیت الکتریکی نورون از زمینه اوسیلوسکوپ جدا شده و وارد برنامه آنالیزکننده کامپیوتری PSTH می گردید. فعالیت نورون حدودا بعد از 30 دقیقه ثبت از نورون حالت ثابت پیدا می کرد.
با اعمال داروهای آگونیست و آنتاگونیست گیرنده A1 اثر آنها بر فعالیت الکتریکی نورونهای هسته PGi (فرکانس در ثانیه) اندازه گیری می شد.
با به کارگیری آگونیست اختصاصی گیرنده A1، سیکلوهگزیل آدنوزین (μM; i.p. 200) بهداخل هسته PGi دردو گروه کنترل و معتاد فعالیت الکتریکی این هسته به مقدار معنی داری کاهش پیدا می کند،به طوری که این کاهش فالیت در گروه معتاد (4/3±5/52 درصد) بارزتر از گروه کنترل بود (1/3±2/35 درصد). همچنینحدود 18-10 دقیقه بعد از به کار گیری 8- فنیل تئوفیلین (mg/kg; i.p. 10) به عنوان آنتاگونیست اختصاصیگیرنده A1 آدنوزینی یک افزایش در فعالیت الکتریکی هسته PGi مشاهده شد که این اثر در گروهمعتاد (%5/2±3/39) مشخص تر از گروه کنترل بود (2/2±2/27 درصد). در آزمایشهای تکمیلی سیکلوهگزیل آدنوزین(CHA) در گروهی از موشها به کار رفت که قبلا کافئین (mg/kg; i.p. 50) را دریافت کرده بودند. نتیجه نشان دادکه CHA در حضور کافئین به عنوان آنتاگونیست عمومی گیرنده های آدنوزینی اثر بارزی بر فعالیت الکتریکی نورونهایهسته PGi ندارد.
نتایج به دست آمده نشان داد که یک افزایش حساسیت در گیرنده های A1 آدنوزینی در موشهای صحرایی نر معتاد به مورفین به وجود می آید که این افزایش حساسیت سبب تغییر الگوی فعالیت الکتریکی نورونهای هسته PGi در طی وابستگی و سندرم ترک می گردد

جداسازی وتخلیص مجموعه آنتی ژنی 85 از مایع کشت باکتری (Culture Filtrate) وبررسی پرولیفراسیون سلولی علیه آن در محیط کشت سلولی خون تام (WB- Whole Blood) افراد سالم با تست توبرکولین مثبت ومنفی مجموعه آنتی ژنی 85 پس از عبور مایع حاصل از کشت میکروبی مایکوباکتریوم بویس (BCG) از ستون های کروماتوگرافی فنیل سفاروز، DEAE - سفاسل و سوپردکس 75 خالص گردید. سپس جهت تائید خالص سازی وحضور آنتی ژن اختصاصی 85 از الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید وایمونوبلاتینگ استفاده گردید.در مرحله بعد با استفاده از روش کشت سلولی خون تام پرولیفراسیون سلولی (از طریق اندازه گیری میزان جذب تیمیدین رادیواکتیو) بر روی سلولهای حاصل از 25 نفر افراد سالم با تست توبرکولین مثبت و25 نفر افراد سالم با تست توبرکولین منفی علیه آنتی ژن 85، PPDو میتوژن محرک لنفوسیت های T (Phytohemagglutinin=PHA) مورد مطالعه قرار گرفت.
مجموعه آنتی ژنی 85 با وزن مولکولی 32-30 کیلو دالتون در الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید شناسائی شد. از سوی دیگر این پروتئین در ایمونوبلاتینگ یک واکنش قوی با آنتی مونوکلونال از خود نشان داد.پاسخ پرولیفراسیون سلولی به آنتی ژن 85 در افراد سالم با تست توبرکولین مثبت به طور معنی داری بیشتر از افراد سالم با تست توبرکولین منفی بود (P<0.001). همچنین88 درصد (25/22) افراد سالم با تست توبرکولین مثبت نسبت به این آنتی ژن پاسخ داده اند.
پاسخ پرولیفراسیون سلولی به مجموعه آنتی ژن 85 به طور معنی داری در افراد سالم با تست توبرکولین مثبت در مقایسه به افراد سالم با تست توبرکولین منفی متفاوت بوده که این موضوع می تواند نشانگر نقش حفاظتی این آنتی ژن علیه عفونت ناشی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس باشد.

بررسی اثر ماده زمینه برون سلولی (ECM) بر خصوصیات ژنوتیپی و فیزیولوژیکی کاردیومیوسیتهای مشتق از سلولهای بنیادی جنینی اجسام شبه جنینی مشتق از سلولهای بنیادی جنینی موش رویان B1 (مشتق از موش C57BL/6) تهیه شدند و بر ECM مشتق از فیبروبلاست قلب (کاردیوژل)، ECM تجاری (ماتریژل) و بدون ECM (کنترل) برای 21 روز کشت شدند. خصوصیات کاردیومیوسیتها با ایمونوسیتوشیمی، RT-PCR و داروهای کرونوتروپی ارزیابی گردید.
میزان ضربان در دقیقه طی روزهای 9-7 در گروه کاردیوژل بیش از کنترل و ماتریژل بود (P<0.05). سلولهای ضرباندار حاصل از سلولهای بنیادی جنینی نشانگرهای کاردیومیوسیتی شامل آلفا-اکتینین، دسیمن، تروپونینی I، زنجیره سنگین میوزین سارکومری (MHC)، پان - کادهرین و کانکسین 43، زنجیره سنگین میوزینی آلفا و بتا و زنجیره سبک میوزینی بطنی و فاکتور ناتری یورتیک دهلیزی (ANF) را بیان می کنند. علاوه بر این ضربان کاردیومیوسیتهای کشت یافته بر ECMs نسبت به ایزوپرنالین بیشتر افزایش می یابد، و کاردیومیوسیتهای کشت یافته بر ماتریژل نسبت به کارباکول بیشتر کاهش می یابد. اما تعداد ضربان بین سه گروه با به کارگیری فنیل افرین، پروپانولول و یا بای-K تفاوت نکرد.
ماده زمینه برون سلولی بعضی صفات کرونوتروپی کاردیومیوسیتهای مشتق از سلولهای بنیادی جنینی را تحت تاثیر قرار می دهد.

کلستریدیوم دیفیسیل (Closrtidium Difficile) عامل اتیولوژیک عفونتهای متعدد از جمله کولیت با غشای کاذب (Pseudomembranous Colitis) است که اغلب با مصرف آنتی بیوتیکها ایجاد می گردد. با این حال، موارد بسیاری نیز بدون دخالت آنتی بیوتیکها گزارش شده است. همچنین این باکتری یکی از عوامل مهم عفونتی های بیمارستانی است و به خاطر ایجاد مقاومت به انواع آنتی بیوتیکها مشکلات فراوانی را ایجاد کرده است. از این رو، دست امر پیشگیری و کنترل عفونتهای ناشی از Closrtidium Difficile به ویژه کولیت با غشای کاذب جلوگیری نماید.
از آنجا که اثرات بیولوژیک پرتوهای یونیزان بر سلولهای زنده از جمله سلولهای رویشی باکتری های به طور دقیق مشخص نشده است. لذا تحقیق و بررسی در این خصوص بسیار حائز اهمیت است. بنابراین، تحقیق حاضر به منظور بررسی اثر پرتوهای Short-Wave و Macro-Wave بر رشد و تولید توکسین از کلستریدیوم دیفیسیل طراحی و انجام شد.
در این تحقیق از دو سویه Closrtidium Difficile یکی توکسی ژن و دیگری غیر توکسی ژن استفاده گردید. ابتدا از هر کدام به طور جداگانه کشت اولیه تهیه شد پس از آن در شیشه های 50 اونسی، 20 میلی لیتر محیط کشت وارد کرده و استریل گردید. سپس با کشت اولیه به نسبت 2 درصد تلقیح و به مدت 24 ساعت در شرایط بی هوازی و دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. پس از آن در زمانهای مختلف تحت تابش مستقیم پرتوهای Macro-Wave و Short-Wave قرار گرفتند. همه محیطهای اشعه دیده و نیز کنترل (محیط اشعه ندیده) به مدت 4 روز گرمخانه گذاری شدند و پس از آن میزان رشد، تولید پروتئین و توکسیسیتی بررسی شدند. رشد باکتری با شمارش تعداد کلنی، مقدار پروتئین با روش براد فورد و توکسیسیتی با استفاده از کشت سلولی رده BK و لوپ گره شده شده ورده خرگوش انجام شد.
نتایج نشان داد، اثر تابش پرتوهای Macro-Wave باعث حذف فعالیت سمی عصاره کشت می گردد. به عبارت دیگر بر تولید توکسین اثر کرده و مانع از تولید توکسین شده است. در حالی که اسپورولاسیون را تحریک نموده و باعث می شود پساز 10 ساعت گرمخانه گذاری همه سلولها به اسپور تبدیل شوند.
همچنین نتایج بررسی اثر پرتوهای Shore-Wave بر رشد و تولید توکسین از Closrtidium Difficile نشان داد، تابش مستقیم به این پرتو به مدت 30 تا 60 دقیقه باعث افزایش پایدار تولید توکسین به میزان 2 برابر می گردد. افزون بر این، تابش مستقیم پرتوهای Short-Wave به کشت 24 ساعته سویه غیرتوکسی ژن Closrtidium Difficile باعث تحریک تولید پایدار توکسین گردد.
در هر حال، یافته های این تحقیق موید آن است که پروهای Macro-Wave باعث حذف تولید توکسین از Closrtidium Difficile شده اما تولید اسپور را القا می نماید. در حالی که اثر پرتوهای Short-Wave بر سویه توکسی ژن، تولید توکسین را القا کرده و آن را به سویه توکسی ژن تبدیل نموده است.

ارزیابی پتانسیل تکوین جنینهای فراگمنت شده انسانی (Fragmented Human Embryos) تا مرحله بلاستوسیست و ارزیابی کیفیت بلاستوسیستهای ایجاد شده از لحاظ اندازه، تعداد سلول، نوع توده سلولی داخلی و تروفواکتودرم و تعداد سلولهای مرده جنینی های دو تا هشت سلولی انسان که فراگمنت شده و برای انجماد نیز مناسب نبودند از آزمایشگاه جنین شناسی پژوهشکده رویان دریافت شد. درجه فراگمنتاسیون جنینها با استفاده از میکروسکوپ معکوس مشخص و بر اساس نحوه توزیع فراگمنتها، در چهار گروه قرار گرفتند (گروه I دارای کمترین میزان فراگمنت، گروه II دارای فراگمنتهای کوچک و پراکنده شده در لا به لای بلاستومرها، گروه III دارای فراگمنتهای بزرگتر تقریبا به اندازه یک بلاستومر و گروه IV فراگمنتها به شکل نکروتیک) و هر گروه به قطره جداگانه ای از محیط کشت rS2 منتقل و روند رشد و تکامل آنها تا روز ششم مورد ارزیابی قرار گرفت (لازم به ذکر است محیط کشت جنینها تا روز سوم محیط rS1 بود). تعداد، اندازه و کیفیت بلاستوسیستهای تشکیل شده، تعداد سلولهای توده سلولی داخلی و تروفواکتودرم با استفاده از رنگ آمیزی افتراقی و تعداد سلولهای مرده هر جنین (آپوپتوتیک و نکروتیک) با استفاده از تکنیک TUNEL در هر جنین شمارش گردید و نتایج با آزمونهای آماری مجذور کای و آنالیز واریانس مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
نتایج حاصله حاکی از آن است که درصد بالایی از جنینهای گروه IV در مرحله دو تا چهار سلولی توقف تقسیم داشتند و نیز در هر چهار گروه میزان بالایی در مرحله هشت سلولی تا مورولا توقف نمودند. میزان تشکیل بلاستوسیست در گروه I و II بیش از گروه های III و IV بود. همچنین یافته ها نشان داد که اندازه بلاستوسیستها در گروه IV به طور معنی داری از گروه های I و II کمتر بوده است. کیفیت بلاستوسیستها به خصوص از نظر توده سلولی داخلی در گروه I و II بهتر بوده و با گروه III و IV تفاوت داشت. نتایج حاصل از رنگ آمیزی افتراقی نیز نشان دهنده این امر است که نسبت سلولهای توده سلولی داخلی به کل سلولهای هر جنین در چهار گروه تفاوت معنی داری ندارد ولی متوسط کل سلولها، متوسط سلولهای ناحیه توده سلولی داخلی و متوسط تروفواکتودرم در هر جنین در گروه های I و II بیش از گروه های III و IV است و نیز نتایج حاصل از رنگ آمیزی TUNEL موید این مطلب است که هر چه تعداد فراگمنتها در جنین چهار سلولی بیشتر و اندازه آنها بزرگتر باشد، در مرحله بلاستوسیست تعداد سلولهای آپوپتوتیک و نکروتیک بیشتر است.
هر چه میزان فراگمنتها در جنین انسان افزایش یابد، پتانسیل تکامل جنینها، اندازه بلاستوسیستها، کیفیت بلاستوسیستها، کیفیت و موقعیت توده سلول داخلی و تروفواکتودرم و تعداد کل سلولهای جنینی کاهش یافته، در عوض تعداد سلولهای مرده در بلاستوسیست افزایش می یابد.