جستجوی مقالات مرتبط با کلیدواژه « Catalytic Domain » در نشریات گروه « پزشکی »
-
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی کردستان، سال بیست و هشتم شماره 3 (پیاپی 126، امرداد و شهریور 1402)، صص 13 -23زمینه و هدف
بوتولیسم، سندروم ناشی از مسمومیت غذایی، به دنبال استفاده از غذای آلوده به سموم عصبی بوتولینوم به وجود می آید که بسیار خطرناک و کشنده هست. بیماری بوتولیسم به علت تاثیر سم باکتری بر پایانه های اعصاب حرکتی ایجاد می شود. نوروتوکسین های بوتولینوم جزء قوی ترین سموم شناخته شده می باشند. هدف از این تحقیق بیان، تخلیص و بررسی میزان ایمونوژنیسیتی پروتیین نوترکیب BoNT/B-HcC به عنوان یک کاندید ایمونوژن در حیوان آزمایشگاهی موش بود.
مواد و روش هاانتهای کربوکسیل ناحیه اتصال دهنده نوروتوکسین بوتولینوم تیپ B به عنوان آنتی ژن مورد ارزیابی های بیوانفورماتیک قرارگرفت. پلاسمید pET17b-BoNT/B-HcC به روش شوک دمایی به باکتریBL21(DE3) E . coli منتقل شد. پروتیین نوترکیب به روش کروماتوگرافی تمایلی، تخلیص و با تکنیک SDS-PAGE بررسی گردید. پس از تایید پروتیین نوترکیب با روش وسترن بلات، ایمنی زایی پروتیین در موش آزمایشگاهی انجام شد. تیتر آنتی بادی با استفاده از الایزای غیرمستقیم ارزیابی و نتایج با آزمون آماری t ارزیابی و مقایسه گردید.
یافته هاژن بهینه سازی شده شاخص سازگاری کدون 0/99 را دارا شد. درصد کدون های با شیوع بالا در ژن به 78 درصد بهبود یافت. توالی ساز ژنی 1119 جفت باز با برش آنزیمی تایید و پروتیین نوترکیب با وزن 43/8 کیلودالتون در میزبان پروکاریوتی بیان گردید. میزان پروتیین خالص شده برای هر لیتر از محیط کشت 23 میلی گرم بود. ایمن سازی موش ها پاسخ آنتی بادی سرمی را القا کرد و آنالیز های آماری نشان داد که میزان تیتر آنتی بادی در مقایسه با نمونه کنترل تفاوت معنی داری دارد.
نتیجه گیریآنتی ژن نوترکیب طراحی شده آنتی ژنیسیته بالایی نشان داد و می تواند به عنوان یک ایمونوژن علیه نوروتوکسین بوتولینوم تیپ B در تحقیقات بعدی مورد بررسی قرار گیرد.
کلید واژگان: کلستریدیوم بوتولینوم, واکسن, ایمنیزایی, آنتیبادی, بخش عملکردی}Background and AimBotulism, a syndrome caused by food poisoning, results from use of food contaminated with the botulinum toxin, which is very dangerous and deadly. Botulism is caused by the effects of bacterial toxins on the terminals of the motor nerves. Botulinum neurotoxins are among the most potent toxins. The aim of this study was to investigate expression, purification and, evaluation of the immunogenicity of the recombinant BoNT/B-HcC protein as an immunogen candidate in mice.
Materials and MethodsThe C-terminus of the receptor-binding domain of botulinum neurotoxin type B(BoNT/B-HcC) was selected as the antigen for bioinformatics evaluations. The pET17b-BoNT/B-HcC plasmid was transferred to E. coli BL21(DE3) by heat shock. The recombinant protein was purified and analyzed by SDS-PAGE. After verification of the recombinant protein by western blot, immunization of mice was performed. Antibody titers of recombinant proteins were evaluated by indirect ELISA and the results were compared using t-test.
ResultsThe codon adaptation index (CAI) of the optimized gene was 0.99. The percentage of codons having high-frequency distribution was improved to 78%. Restriction analysis confirmed the 1119 bp construct gene and the recombinant protein with a molecular weight of 43.8 kDa was expressed in the prokaryotic host. The total yield of purified protein was 23 mg of protein per liter of culture. Immunization of mice induced serum antibody response. Statistical analysis showed that the antibody titer was significantly different compared to that of the control sample.
ConclusionThe designed recombinant antigen showed high antigenicity that could be considered as an immunogen against botulinum type B neurotoxin in future studies.
Keywords: Clostridium botulinum, Vaccine, Immunizations, Antibody, Catalytic domain} -
اهدافنوروتوکسین های بوتولینوم، از قوی ترین سم های شناخته شده هستند که با مهار آزادسازی میانجی عصبی استیل کولین، موجب ایجاد فلج شل عضلانی می شود. طراحی مهارکننده ها هنوز به عنوان یک راهبرد اصلی برای مهار درون سلولی مسمومیت های ناشی از سموم مذکور به شمار می آید. برای بررسی پتانسیل عملکرد مهارکننده های طراحی شده، به سم خالص یا ناحیه کاتالیتیک آن نیاز است. هدف مطالعه حاضر، بررسی بیان و تخلیص ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E BoNT/E)) نوترکیب از یک ژن صناعی بود.مواد و روش هادر مطالعه تجربی حاضر، توالی زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E از بانک ژن به دست آمد و بهینه سازی کدونی براساس E. coli BL21 انجام شد. سایر بررسی های بیوانفورماتیک لازم برای بیان بهتر ژن صورت گرفت. توالی ژن برای سنتز و همانندسازی در وکتور pET28a(+) سفارش داده شد. وکتور نوترکیب داخل باکتری E. coli BL21 انتقال و بیان پروتئین با ایزوپروپیل تیو-بتا-دی گالاکتوزیداز (IPTG) القا شد. برای بیان محلول، در شرایط بیانی تغییر صورت گرفت. سپس به وسیله کروماتوگرافی تمایلی و فیلتر آمیکون پروتئین خالص سازی شد. برای بررسی بیان و خالص سازی پروتئین SDS-PAGE و برای تایید پروتئین بیان شده تکنیک وسترن بلات به کار رفت.یافته هاشاخص سازگاری کدون ژن به 0/85 افزایش یافت. ساختار سوم پیش بینی شده کیفیت مناسب را نشان داد. ساختار mRNA نشان داد، ساختار پیش بینی شده پایدار بود. بیان محلول پروتئین در شرایط °C18 به مدت 18ساعت با القای IPTG، یک میلی مولار به دست آمد. تولید پروتیئن و با خلوص بالای 90% تایید شد.نتیجه گیریبهینه سازی شرایط بیان پروتئین زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E موجب تولید محلول آن در محیط کشت توسط میزبان E. coli BL21 می شود.کلید واژگان: توکسین بوتولینوم تیپ E, زنجیره سبک, ناحیه کاتالیتیک, پروتئین های نوترکیب}Aims: Botulinum neurotoxins are the strongest known bacterial toxins that cause muscle paralysis due to inhibition of acetylcholine release. Design of inhibitors is still pursued as a major strategy for intracellular inhibition of poisoning caused by these toxins. Investigation of the potential function of design inhibitors, pure poison or catalytic area is essential. The aims of present study were expression and purification of recombinant catalytic domain of botulinum neurotoxin type E (BoNT/E) Type E from a synthetic gene.Materials And MethodsIn this experimental study, the sequence of the botulinum neurotoxin type E light chain was adopted from GeneBank and codons were optimized according to E.coli BL21 (DE3) codon usage. Other bioinformatics tools were exploited to reach the optimum expression of the gene in the mentioned host. The resultant (gene) was then ordered to synthesize and cloning in pET28a () expression vector. The recombinant vector was transferred into E. coli BL21 (DE3) host cells. The expression of the protein was induced by addition of IPTG. The expression conditions were changed to obtain a soluble expression of the protein. Then, the protein was purified by an affinity chromatography, followed by a further purification with amicon filter. SDS-PAGE was used to evaluate expression and purification of the protein and Western blotting was performed to confirm the expressed protein.
Finding: Codon Adaptation Index of the gene increased to 0.85. The third predicted structure showed good quality. The thermodynamic analysis of the mRNA structure showed that the predicted structure is stable. The soluble expression was obtained in 18°C and 18h induction by 1 mM IPTG. Protein production with higher more than 90% purity was confirmed.ConclusionOptimization of the protein expression conditions resulted in producing the solution in the culture medium by E. coli BL21 as host.Keywords: Botulinum toxin Type –E, Immunoglobulin Light Chain, Catalytic Domain, ?Recombinant Proteins} -
زمینه و هدفسم بوتولینوم تیپ A به لحاظ ساختاری از یک زنجیره سبک به وزن 50 کیلودالتون و یک زنجیره سنگین به وزن 100 کیلو دالتون تشکیل شده است که توسط یک باند دی سولفید به هم متصل شده اند. این پروتئین شامل سه بخش (Domain) است که بخش زنجیره سبک آن دارای فعالیت آنزیمی می باشد. در این پژوهش، هدف ما از تولید نوترکیب بخش عملکردی به دست آوردن یک پروتئین مناسب جهت بررسی ایمنی زایی آن است.روش بررسیباکتری در شرایط بی هوازی رشد داده شد سپس DNA کروموزومی به روش قلیایی استخراج گردید. پس از بررسی ترادف ژن مربوطه و طراحی پرایمر قطعه مورد نظر از طریق واکنش های زنجیره ای پلیمرازی (PCR) فراوان سازی شد. محصول PCR بر روی سه ناقل بیانیpRSETA، pET28a و pET32a همسانه سازی گردید. پروتئین حاصل از بیان توسط SDS-PAGE بررسی و صحت محصول با روش وسترن بلاتینگ و واکنش الیزا مورد تایید نهایی قرار گرفت و سپس به وسیله کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص سازی شد، ایمنی زایی بر روی موش سوری در سه مرحله صورت گرفت و نتایج آن مورد بررسی قرار گرفت.یافته هادر این تحقیق بالاترین بیان در شرایط غلظت 0.5 میلی مولار IPTG، جذب نوری 0.6 و زمان القای 15 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد به دست آمد. پروتئین بیان شده توسط ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص سازی گردید. آنتی بادی حاصل از تزریق پروتئین نوترکیب توانست مانع از مرگ موش ها در دوز LD50 100 شود.نتیجه گیریهر چند بیان ژن هایی با درصد بالایی از AT در سیستم Ecoli ضعیف می باشد ولی ما در این تحقیق توانستیم بیان مناسبی به دست آوریم. تخلیص پروتئین نوترکیب در مراحل اولیه به دلیل اتصال ضعیف هیستیدین انتهایی به ستون دشوار بوده که با تغییر در روش ها این پروتئین تا 90 درصد خالص سازی شد. در بحث ایمنی زایی پروتئین نوترکیب مورد نظر نیز مشخص شد که آنتی بادی های تولید شده در مقایسه با آنتی بادی تولید شده علیه بخش اتصال دهنده از ایمنی زایی پایینی برخوردار است.
کلید واژگان: کلستریدیوم بوتولینوم تیپ A, بخش عملکردی, واکنش زنجیره ای پلیمراز, پروتئین نوترکیب}Background And ObjectiveBotulinum neurotoxin type A, structurally consists of a 50KD light chain and a 100 KD heavy chain linked by a disulfide bond. The protein can further be divided into three functional domains of which catalytic domain corresponds to the light chain. In this research we aimed to produce recombinant catalytic domain in order to obtain a protective protein.Materials And MethodsBacteria were grown in anaerobic conditions and genomic DNA was extracted by alkaline method. Following the gene coding a set of primers was designed and the catalytic domain was amplified through PCR. The PCR product was then cloned into three expression vectors namely pRSETA, pET28a and pET32a. The expressed protein was analyzed on SDS-PAGE and confirmed by ELISA and western blotting and then purified by affinity chromatography.ResultsIn this research the maximum expression was obtained at 0.5 mM IPTG,OD600:0.6 and 15 hours of induction at 30˚C. The protein so expressed was purified by affinity coulmn chromatography. The antibody raised against recombinant protein could protect the rats by 100 LD50.DiscussionThough the expression of AT- rich genes in E.coli system is low, we could obtain an appropriate level of expression in this study. The purification of recombinant protein in the early stages was elusive in the extreme by affinity chromatography due to the weak binding of histidine N-terminal to the column, howerer 90% purification was achieved through modification of the technique. The antibody produced against this domain was less protective compared to that of binding domain.Keywords: Clostridium botulinum type A, Catalytic domain, PCR, Recombinant protein}
- نتایج بر اساس تاریخ انتشار مرتب شدهاند.
- کلیدواژه مورد نظر شما تنها در فیلد کلیدواژگان مقالات جستجو شدهاست. به منظور حذف نتایج غیر مرتبط، جستجو تنها در مقالات مجلاتی انجام شده که با مجله ماخذ هم موضوع هستند.
- در صورتی که میخواهید جستجو را در همه موضوعات و با شرایط دیگر تکرار کنید به صفحه جستجوی پیشرفته مجلات مراجعه کنید.