کلون کردن قطعه اتصالی m2e آنفلوانزا- ctxB ویبریو کلرا در پلاسمید pET28a

از آنجا که دومین خارجی پروتئین ماتریکس آنفلونزا ایمونوژن ضعیفی است انتخاب مناسبی جهت تولید واکسن نمی باشد. زیرواحد B انتروتوکسین وبا بخش غیر سمی و موجب اتصال هولوتوکسین به GM1 موجود در سطح سلول های اپیتلیال روده می شود. CTB به شدت ایمونوژن می باشد. از اینرو اتصال این دو ژن کاربرد زیادی در تهیه واکسن نوترکیب آنفلونزا خواهد داشت.
از طریق PCR و با استفاده از پرایمر های اختصاصی حاوی جایگاه برش آنزیم محدود کننده ژن ctxB تکثیر شد. سویه استاندارد آنفلونزا نوع A (A/ PUERTO RICO /8/34) تهیه و ژن M2e از طریق RT-PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی حاوی جایگاه برش تکثیر گردید. جهت اتصال دو ژن ctxB و M2e واکنش PCR دوم به وسیله پرایمر R ژن ctxB و پرایمر F ژن M2e انجام گرفت. محصول PCR با استفاده از آنزیم های BamH1 و EcoR1 هضم و در وکتور pET28a کلون گردید. تائید کلونینگ با استفاده تعیین توالی صورت گرفت. پس از تائید، وکتور نوترکیب pET28a/M2e-ctxB در باکتری E.coli سویه Top10 ترانسفورم گردید. تائید نهایی فیوژن، کلونینگ و ترانسفورمیشن از طریق PCR کلنی، هضم آنزیمی و تعیین توالی صورت گرفت.
آنالیز توالی نشان داد ژن M2e در فریم مناسب به ژن ctxB متصل شده بود. علاوه بر این ژن حاصل در محل برش آنزیم های BamH1 و EcoR1 در وکتور pET28a کلون گردیده بود.
از آنجا که توالی ژن M2e آنفلونزا دچار تغییرات آنتی ژنیک سالیانه نمی شود کاندید مناسبی جهت تولید واکسن آنفلونزا می باشد.با توجه به اینکه M2e ایمونوژن بسیار ضعیفی می باشد فیوژن آن با ایمونوژن های قوی مانند CTB می تواند روشی نوین در تهیه واکسن نوترکیب آنفلونزا باشد.