بهبود و توسعه میزان بیان، حلالیت و تسهیل تخلیص آنزیم نوترکیب پروتئاز (rPR) ویروس HIV با روش TOPO-Cloning در باکتری B L21 E.coli

پروتئاز HIV نقش مهمی در بلوغ ویروس و تحریک پاسخ ایمنی میزبان دارد. به همین دلیل می تواند هم به عنوان یک هدف درمانی و هم در تست های تشخیصی کاربرد داشته باشد. در مطالعات قبلی، تولید rPR با مشکلاتی مثل سمیت، آبگریز بودن و تخلیص روبرو بوده است. هدف از این مطالعه، استفاده از سیستم بیانی pET102/D.TOPO برای غلبه بر مشکلات اشاره شده بود.
پس از جداسازی ژن پروتئاز از ژنوم HIV، فرایند کلونینگ با استفاده از سیستم TOPO Cloning در وکتور بیانی pET102/D.TOPO انجام شد. بعد از القای بیان ژن با IPTG، پروتئین تولید شده با استفاده از روش کروماتوگرافی حاوی ستون Ni-NTA تخلیص شد و غلظت آن با استفاده از کیت بررسی پروتئین BCA سنجیده شد. تولید پروتئین نوترکیب با SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ بررسی شد.
کلونینگ ژن پروتئازHIV-1 با استفاده از سیستم کلونینگ TOPO در وکتور بیانی pET102/D بوسیله PCR با موفقیت صورت گرفت و با sequencing تایید شد. غلظت rPR پس از تخلیص بین 60 تا 85 میکروگرم در میلی لیتر بود. بیان و تولید rPR به شکل محلول، با موفقیت انجام شد. و با SDS-PAGE و وسترن بلات تایید شد.
در سیستم کلون سازی مورد استفاده به دلیل بیان rPR به صورت فیوز شده با تیوردوکسین و دارای برچسپ های هیستیدینی، مشکل سمیت،آبگریز بودن و تخلیص تا حد زیادی برطرف شد. با توجه به میزان rPR تولید شده، می توان از آن در تست های تشخیصی و جهت بررسی و طراحی مهارکننده های پروتئاز در مطالعات بعدی استفاده کرد.