اندازه گیری آنتی بادی تولید شده علیه کپسول پلی ساکاریدی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات استخراج شده از هموفیلوس آنفلوانزای تیپ b سویه ی محلی Atf2 با روش Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

هموفیلوس آنفلوانزای تیپ b (HIb یا Haemophilus influenza b) یک ارگانیزم کپسول دار و عامل اصلی مننژیت در کودکان در جهان می باشد. آنتی ژن کپسول پلی ساکاریدی HIb یک پلیمر تکراری از ریبوزیل ریبیتول فسفات و مهم ترین عامل ویرولانس و مسبب عفونت های بسیار در کودکان زیر 5 سال به خصوص کودکان زیر 2 سال می باشد. کپسول پلی ساکاریدی کانژوگه با یک حامل پروتئینی، در جلوگیری از چنین عفونت هایی بسیار موثر است.
در این مطالعه، HIb سویه ی Atf2 جدا شده از یک کودک مبتلا به مننژیت، در فرمانتور حاوی محیط اصلاح شده ی Giolitti-Cantoni broth (GC broth) کشت داده شد. کشت حاصل، بعد از غیر فعال شدن با استفاده از روش های مختلف تخلیص و آنتی ژن پلی ساکاریدی (PRP یا Polyribosylribitolphosphate) تهیه شده بعد از عبور از فیلتر 25/0 میکرومتری با توکسوئید کزاز (TT یا Tetanus toxoid) به عنوان حامل پروتئینی کونژوگه گردید. محصول کونژوگه، پس از عبور از ژل سفارز CL-4B جداسازی شد و به عنوان محصول کونژوگه PRP-TT مورد استفاده قرار گرفت.
مقدار PRP موجود در محصول کونژوگه 402 میکروگرم از 109 باکتری در هر میلی لیتر تخلیص شد. مقدار پروتئین و اسیدنوکلئیک موجود در PRP مطابق با مقدار توصیه شده توسط World Health Organization (WHO) زیر 1 درصد بود. بازیافت PRP موجود در محصول کونژوگه بعد از استفاده از Sodium deoxycholate (DOC)، 58 درصد بود که نشان دهنده ی مقدار بالای اتصال PRP و پروتئین اولیه بود. پاسخ آنتی بادی علیه محصول کونژوگه (PRP-TT) تهیه شده در نوزاد رت با نژاد ویستار با روش Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) غیر مستقیم اندازه گیری و بالاترین تیتر برای محصول کونژوگه نسبت به PRP استخراج شده در آزمایشگاه و PRP استاندارد خریداری شده از موسسه ی بین المللی استانداردهای بیولوژی در لندن (National Institute for Biological Standards And Control یا NIBSC) به دست آمد. در تیتر آنتی بادی به دست آمده برای PRP تخلیص شده و خریداری شده از NIBSC در غلظت برابر آنتی ژن و رقت 200/1 آنتی بادی شباهت زیادی دیده شد که این نشانگر خلوص PRP تهیه شده در آزمایشگاه می باشد.
روش تخلیص PRP، کونژوگاسیون و ایمنی زایی محصول کونژوگه در مدل حیوانی نوزاد رت روشی مقرون به صرفه و عملی با خلوص بالا است که می توان از آن درتولید واکسن HIb با حجم بالا (Scale up) استفاده کرد.